基于同位素標記定量分析煙堿誘導SH-SY5Y細胞的差異表達蛋白

朱貝貝 李翔宇 陳歡 王紅娟 侯宏衛 胡清源

（國家煙草質量監督檢驗中心，鄭州 450001）

基于同位素標記定量分析煙堿誘導SH-SY5Y細胞的差異表達蛋白

朱貝貝 李翔宇 陳歡 王紅娟 侯宏衛 胡清源

（國家煙草質量監督檢驗中心，鄭州 450001）

以煙堿誘導后的人神經母瘤細胞株為材料，分析煙堿處理后細胞蛋白表達譜的變化，應用iTRAQ標記結合nano-LC-Q-TOF MS技術，鑒定煙堿誘導神經元細胞的差異表達蛋白質并對其進行生物信息學分析。結果顯示，煙堿處理組與對照組相比共有132個蛋白差異表達（|ratio|≥1.5，P＜0.05），差異表達的蛋白主要參與基因表達、MAPK級聯反應、GTP調節信號傳導和神經營養因子TRK受體信號傳導等生物學過程。其中煙堿可能通過改變蛋白酶體調節神經細胞的平衡性而產生煙堿依賴，MAPK級聯反應和泛素化-蛋白酶體通路在這一過程中發揮重要作用。

差異蛋白組學；iTRAQ；煙堿；SH-SY5Y

與酒精、嗎啡、大麻、可卡因等致癮性藥物相似，反復抽吸含有煙堿的卷煙，也能導致成癮。卷煙煙氣中，煙堿是引起習慣性抽煙的主要成分，也是吸煙致癮的主要原因［1，2］。但是，煙堿成癮相關的分子機制尚不清楚，需要對煙堿成癮相關分子機制展開進一步研究。研究表明，反復接觸致癮性藥物可以誘導腦部特定區域蛋白質表達水平的改變，這種表達的改變將介導個體神經元和神經通路的改變，進而導致成癮［3，4］。已有研究表明煙堿可以誘導大鼠前額皮質、杏仁核、伏隔核和紋狀體區域發動蛋白、層粘連蛋白受體，醛縮酶、α-烯醇酶1和N-馬來亞酰胺融合蛋白顯著差異表達［5，6］。因此，研究成癮蛋白質表達水平的變化，可以為研究成癮相關的分子機制提供重要的數據支撐和理論解釋。

目前各種分子技術已被用來研究與藥物成癮相關蛋白質表達的變化。蛋白組學技術可以整體獲得藥物成癮過程中蛋白質組的動態變化，為更好的理解藥物成癮的分子機制提供強有力的工具［7］。細胞模型可以簡化模型的復雜程度，觀察單一類型細胞蛋白質的變化，鑒定一些在成癮中發揮重要作用的低豐度蛋白，而且實驗條件可控，如溫度、煙堿濃度和暴露時間［8］，煙堿誘導蛋白質分子水平地改變更容易檢測。

因此，本研究使用人神經母瘤細胞（SH-SY5Y）作為體外研究煙堿成癮相關蛋白質表達的細胞系。以同位素相對標記與絕對定量（iTRAQ）蛋白組學技術通過nao-LC-Q-TOF分離鑒定煙堿誘導組和對照組蛋白表達的差異，最終，通過生物信息學分析差異表達蛋白質的細胞組成、生物過程、生物功能和參與的相關信號通路（圖1），結果將有助于理解調控煙堿成癮相關的生物過程。

圖1 煙堿誘導SH-SY5Y細胞蛋白質差異表達的分析流程

1 材料與方法

1.1 材料

材料：SH-SY5Y（美國 ACTT細胞庫）。

試劑：DMEM培養基和青鏈霉素（美國Hyclone公司）；優級胎牛血清（美國Gibco公司）；PBS，二硫蘇糖醇（DTT），碘乙酰胺（IAA），四乙銨（TEAB）（美國Sigma公司）；乙腈（ACN）、尿素、甲酸（FA）、質譜級胰酶和N-PER神經蛋白提取液（Promega公司）；iTRAQ試劑盒（美國AB Sciex公司）；儀器：Nano-LC9（Thermo）-Q-TOF MS（德國Bruker），多功能酶標儀（美國Molecular Devices），真空冷凍干燥機（德國CHRIST）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和收集 細胞接種后，在37℃、5% CO2條件下培養，使用含有10%血清和1%雙抗的DMEM培養基，當細胞的融合度達到80%時隨機分為實驗組和對照組各3瓶分別在有無1 mmol/L的煙堿培養基中培養1 h后，酶解消化收集，使用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗后加入蛋白提取液，BCA法蛋白定量。

1.2.2 蛋白定量標記 分別取100 μg細胞全蛋白每組做2次重復實驗，定容到30 μL；加3倍體積（0.01 mol/L DTT、8 mol/L尿素、0.1 mol/L Tris-HCL（pH8.5））的還原劑，37℃水浴1 h；加入與還原劑等體積的烷基化試劑（0.05 mol/L IAA、8 mol/L尿素、0.1 mol/L Tris-HCL（pH8.5））室溫避光20 min；將蛋白溶液移入10 kD的超濾管中離心40 min（12 000×g，4℃），將未反應液體全部離心；向每個超濾管中加入150 μL的0.3 mol/L TEAB離心40 min（12 000×g，4℃），將未反應的液體全部離心下去，重復3次；然后按20∶1比例加入胰蛋白酶37℃酶解16 h；將酶切好的樣品室溫下離心10 min（12 000×g，4℃），加100 μL的0.2 mol/L TEAB， 室 溫 離 心20 min（12 000×g），重復上述步驟2次；酶解消化后的肽段溶液離心于收集管底；冷凍干燥后，向其中加入100 μL 0.2 mol/L TEAB 使其濃度為1 μg/μL充分混勻，向4管對應iTRAQ標簽（分子量分別為114、115、116和117的標簽）中加入200 μL乙醇，115、116標記對照組，114、117標記實驗組；室溫反應2 h，加400 μL色譜水終止反應30 min；混合后經seppark C18柱除鹽，凍干。

1.2.3 肽段液相分離 將凍干后的樣品用0.1%甲酸水溶液復溶上到Trap柱（100 μm×2 cm，C18，5 μm），由流動相A（0.1%甲酸水）和B（0.1%甲酸乙腈）經梯度（表1）洗脫到分析柱（75 μm×50 cm，C18，2 μm）。

1.2.4 質譜鑒定 液相色譜分離后進入Q-TOF MS（Bruker）鑒定。采用CaptiveSpray離子源，在正離子模式下，毛細管電壓為4 500 V，干燥氣體流速為4.0 L/min，干燥溫度為180℃，固定循環掃描時間為3 s，質譜全掃描質量范圍50-2 200 m/z，二級質譜全掃描質量范圍50-2 200 m/z，碰撞能量范圍為23-65 eV進行信號采集。

1.2.5 數據庫檢索 使用Mascot（Version 2.4.1）搜索引擎對Uniprot-human數據庫搜庫。搜庫參數：最大漏切位點數2；半胱氨酸脲甲基化固定修飾、蛋氨酸可變氧化修飾、N端乙酰化可變修飾；定量：iTRAQ 4標；肽端允許誤差：20 ppm；MS/MS允許誤差：0.1 Da，顯著閾值：P＜0.05。

1.2.6 定量蛋白質組學和生物信息學分析 利用iTRAQ定量的比值（代表實驗組/對照組平均值表達量比值的4個ratio值的平均值）篩選出暴露組和對照組的差異表達的蛋白。使用DAVID對差異蛋白質進行生物過程，細胞組成，生物功能進行分析，KEGG進行生物通路分析。搜索STRING數據庫并構建差異蛋白互作模型。

表1 流動相梯度

2 結果

2.1 蛋白質組鑒定和iTRAQ定量分析

對1 mmol/L煙堿暴露1 h的SH-SY5Y進行iTRAQ差異蛋白組學分析，在煙堿暴露組和實驗組中共鑒定到1 316種蛋白質，其中1 273種蛋白有定量信息，iTRAQ標記效率為96.7%，表明標記效率良好。對照組兩次重復標記定量蛋白比值95%的置信區間分布在（1.091，1.147）；實驗組兩次重復標記定量蛋白比值95%的置信區間分布在（1.099，1.142），表明重復性好，實驗結果可靠。由于體系偏差的存在，為減少假陽性的結果，至少選擇有兩個定量肽段、|比值|≥1.5倍且單樣本t檢驗P＜0.05的蛋白為差異蛋白，共篩選出132種差異蛋白。

圖2 差異蛋白亞細胞定位

2.2 差異蛋白功能分類分析

使用DAVID軟件依據Gene Ontology條目對132個差異蛋白進行GO分析，這些蛋白質顯著富集了58種生物學過程，30種細胞組成和22種分子功能。顯著富集的細胞位置主要包括胞外體（45.54%），細胞質（43.56%），核（43.56%），膜（36.63%），線粒體（20.79%）和蛋白酶體復合物（8.91%）等（圖2）。根據分子功能注釋（圖3）顯著富集的分子功能主要為結合蛋白質和活性蛋白質。根據生物過程注釋（圖4），主要的生物過程為小分子代謝（27.7%），基因表達（25.7%），細胞氮化合物代謝過程（16.8%）和病毒過程（15.8%），此外還有GTP調節信號傳導（12.8%），MAPKK激活（6.9%），MAPK級聯（6.9%）和神經營養因子TRK信號通路（6.9%）等生物過程（圖4）。

圖3 差異蛋白分子功能分析

圖4 差異蛋白生物過程分析

2.3 差異蛋白信號通路分析

對上述132種顯著差異表達的蛋白質進行KEGG分析，參與的生物通路主要包括代謝途徑，泛素化-蛋白酶體通路，精氨酸和脯氨酸代謝，系統性紅斑狼倉和氨酰tRNA生物合成。此外，還有與細胞外粘附，連接相關的通路，和細胞內質網蛋白質加工，谷胱甘肽代謝，RNA轉運，肌動蛋白細胞骨架，鈣信號通路和cGMP-PKG信號通路，及神經疾病相關的酒精成癮和亨廷頓病相關的通路。

2.4 差異蛋白互作分析

對上述132顯著差異的蛋白質進行STRING蛋白質互作分析，117個蛋白質均與STRING數據庫中的蛋白質匹配（圖5）。該網絡以（圖5紅色圈出蛋白）蛋白酶體家族、核糖體蛋白家族、真核翻譯起始因子、氨酰t-RNA合成酶和乙醛脫氫酶18家族A1（表2）等蛋白質為中心，向四周擴散，在煙堿誘導的神經元細胞蛋白質的表達中發揮重要作用。

表2 網絡互作中心蛋白

3 討論

根據生物信息學分析的結果，位于互作網圖交匯點的差異表達蛋白包括蛋白酶體家族，核糖體蛋白家族，真核翻譯起始因子，氨酰-tRNA合成酶和乙醛脫氫酶18家族A1。差異表達的蛋白酶體蛋白主要包括PSMB1、PSMB2、PSMB5、PSMD2、PSMD12、PSMC6和PSMA1，這與Kane等［11］發現煙堿誘導大鼠前額皮質中蛋白酶體顯著差異表達結果相似。這些差異表達的蛋白酶體蛋白主要參與MAPK級聯生物過程和泛素-蛋白酶體通路。煙堿通過α7nAChR乙酰膽堿受體誘導MAPK級聯反應［12-14］，能夠進一步激活其下游的長時程增強效應和長期記憶［15，16］；泛素化-蛋白酶體通路中,蛋白酶體能夠識別并清除泛素化的蛋白，維持煙堿誘導生物體產生蛋白質的穩態［11，17］，長期的煙堿暴露將導致神經元突觸可塑性［18］。差異表達的核糖體蛋白主要包括L27A、L8、L31、S23和S5，這與煙堿暴露小鼠皮層神經元的研究中發現一致［19］。差異表達的核糖體蛋白和酰胺酰t-RNA合成酶主要參與蛋白質的合成，這可能是由于蛋白合成上游的信號級聯反應如蛋白激酶C和PI3K信號通路被煙堿抑制［19］。在安非他命急性誘導小鼠大腦區域的研究中，氨酰t-RNA合成酶基因同樣存在差異表達，影響安非他命依賴［20］。因此，酰胺酰t-RNA合成酶對煙堿依賴的形成影響值得進一步的研究。值得注意的是，本研究發現的ALDH18A1顯著差異表達，尚未見相關報道。多項研究指出，乙醛與煙堿共同暴露增強大鼠的煙堿依賴程度［21］，由于ALDH18A1是乙醛氧化為乙酸反應的催化劑， ALDH18A1可能在煙堿和乙醛的協同依賴中發揮重要作用。

圖5 差異蛋白互作網絡分析

在神經退行性疾病的通路中，差異蛋白的表達包括超氧化物歧化酶（SOD1）、電壓依賴陰離子通道1（VDAC1）和電壓依賴陰離子通道3（VDAC3）。研究表明，煙堿對突觸前后信號調節與神經退行性疾病亨廷頓病，帕金森綜合癥顯著相關［22，23］。SOD1過表達在神經退行性疾病中具有保護作用，影響生物體氧化防御系統［24，25］；VDAC1和VDAC3蛋白家族位于線粒體外膜上，VDAC缺失小鼠的學習能力和突觸可塑性都有所減弱［26］；另外，VDAC蛋白通過偶聯乙酰膽堿受體，影響煙堿與煙堿乙酰膽堿受體的結合［27］。目前，煙堿對SOD1、VDAC1和VDAC3蛋白表達的影響還未見報道。

4 結論

本研究通過iTRAQ蛋白組學技術初步鑒定了煙堿誘導神經元蛋白質的差異表達，共鑒定篩選出132個差異表達蛋白，差異表達的蛋白質中蛋白酶體、真核翻譯起始因子、氨酰-tRNA合成酶核糖體蛋白、ALDH18A1位于蛋白質互作的中心，在煙堿誘導神經元蛋白質的表達中發揮重要作用。但煙堿誘導差異表達的蛋白在神經元中的作用仍需要進一步驗證，這些差異表達的蛋白在煙堿依賴的形成中如何發揮作用的，仍需要動物成癮模型進行進一步的評估。

［1］Subramaniyan M, Dani JA. Dopaminergic and cholinergic learning mechanisms in nicotine addiction［J］. Annals of the New York Academy of Sciences, 2015, 1349（1）：46-63.

［2］Prochaska JJ, Benowitz NL. The Past, present, and future of nicotine addiction therapy［J］. Annual Review of Medicine, 2015, 67（1）：411-420.

［3］Wong CC, Mill J, Fernandes C. Drugs and addiction：an introduction to epigenetics［J］. Addiction, 2011, 106（3）：480-490.

［4］Renthal W, Nestler EJ. Chromatin regulation in drug addiction and depression［J］. Dialogues in Clinical Neuroscience, 2009, 11（3）：257-268.

［5］Hwang YY, Li MD. Proteins differentially expressed in response to nicotine in five rat brain regions：Identification using a 2-DE/MS-based proteomics approach［J］. Proteomics, 2006, 6（10）：3138-3153.

［6］Yeom M, Shim I, Lee HJ, et al. Proteomic analysis of nicotineassociated protein expression in the striatum of repeated nicotinetreated rats［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 326（2）：321-328.

［7］Hemby SE. Cocainomics：new insights into the molecular basis of cocaine addiction［J］. Journal of Neuroimmune Pharmacology, 2010, 5（1）：70-82.

［8］Bodzon-Kulakowska A, Suder P, Mak P, et al. Proteomic analysis of striatal neuronal cell cultures after morphine administration［J］. J Sep Sci, 2009, 32（8）：1200-1210.

［9］Benowitz NL. Nicotine addiction［J］. The New England Journal of Medicine, 2010, 362（24）：311-631.

［10］Dajas-Bailador F, Wonnacott S. Nicotinic acetylcholine receptors and the regulation of neuronal signalling［J］. Trends in Pharmacological Sciences, 2004, 25（6）：317-324.

［11］Kane JK, Konu ?, Ma JZ, et al. Nicotine coregulates multiple pathways involved in protein modification/degradation in rat brain［J］, Molecular Brain Research. 2004, 132（2）：181-191.

［12］Arora K, Cheng J, Nichols RA. Nicotinic acetylcholine receptors sensitize a MAPK-linked toxicity pathway on prolonged exposure to β-Amyloid［J］. Journal of Biological Chemistry, 2015, 290（35）：21409-21420.

［13］Schaal C, Chellappan SP. Nicotine-mediated cell proliferation and tumor progression in smoking-related cancers［J］. Molecular Cancer Research, 2014, 12（1）：14-23.

［14］Tang K, Wu H, Mahata SK, et al. A crucial role for the mitogenactivated protein kinase pathway in nicotinic cholinergic signaling to secretory protein transcription in pheochromocytoma cells［J］. Molecular Pharmacology, 1998, 54（1）：59-69.

［15］Picciotto MR. Nicotine-mediated activation of signal transduction pathways［J］. Novartis Foundation Symposium, 2008, 275（2）：83-95.

［16］Lykhmus O, Mishra N, Koval L, et al. Molecular mechanisms regulating LPS-induced inflammation in the brain［J］. Frontiers in Molecular Neuroscience, 2016, 19（9）：1-13.

［17］Li MD, Kane JK, Wang J, et al. Time-dependent changes in transcriptional profiles within five rat brain regions in responseto nicotine treatment［J］. Brain Research Molecular Brain Research, 2004, 132（2）：168-180.

［18］Ehlers MD. Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system［J］. Nature Neuroscience, 2003, 6（3）：231-242.

［19］Wang J, Gutala R, Sun D, et al. Regulation of platelet-derived growth factor signaling pathway by ethanol, nicotine, or both in mouse cortical neurons［J］. Alcoholism Clinical & Experimental Research, 2007, 31（3）：357-375.

［20］Sokolov BP, Polesskaya OO, Uhl GR. Mouse brain gene expression changes after acute and chronic amphetamine［J］. Journal of Neurochemistry, 2003, 84（2）：244-252.

［21］ Belluzzi JD, Wang R, Leslie FM. Acetaldehyde enhances acquisition of nicotine self-administration in adolescent rats［J］. Neuropsychopharmacology, 2005, 30（4）：705-712.

［22］Quik M, Perez XA, Bordia T. Nicotine as a potential neuroprotective agent for Parkinson's disease［J］. Movement Disorders, 2012, 27（8）：947-957.

［23］Dineley KT. Nicotinic acetylcholine receptors in Alzheimer’s and Parkinson’s disease［M］. Springer New York, 2014：383-415.

［24］Song G, Nesil T, Cao J, et al. Nicotine mediates expression of genes related to antioxidant capacity and oxidative stress response in HIV-1 transgenic rat brain［J］. Journal of Neurovirology, 2015, 22（1）：114-124.

［25］Lin C, Yona JM, Lee BJ, et al. Antiteratogenic effects of β-Carotene in cultured mouse embryos exposed to nicotine［J］. Evidencebased Complementary and Alternative Medicine, 2013, 2013（2）：70-75.

［26］王紅霞, 何家田, 劉炳玉, 等. 電壓依賴性陰離子通道蛋白1和G蛋白N端乙酰化的納升電噴霧串聯質譜分析［C］. 中國蛋白質組學學術大會, 2005.

［27］Lykhmus O, Gergalova G, Koval L, et al. Mitochondria express several nicotinic acetylcholine receptor subtypes to control various pathways of apoptosis induction［J］. International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 2014, 53（7）：246-252.

（責任編輯 李楠）

iTRAQ-based Quantitative Proteomic Analyses of Differentially Expressed Proteins in Nicotine-induced SH-SY5Y Cells

ZHU Bei-bei LI Xiang-yu CHEN Huan WANG Hong-juan HOU Hong-wei HU Qing-yuan
（China National Tobacco Quality Supervision & Test Centre，Zhengzhou 450001）

SH-SY5Y，induced by nicotine，was used to seek the effects of nicotine exposure on the alteration of proteins expression profile. The differentially expressed proteins in nicotine-induced neuronal cells were identified using the iTRAQ and nano-LC-Q-TOF MS proteomics，and their bioinformatics was also analyzed. The results showed that the levels of 132 proteins were differentially altered in response to nicotine（| ratio | ≥ 1.5，P＜0.05），including proteins involved in gene expression，MAPK cascade，GTP signal transduction and neurotrophin TRK receptor signaling. Together，our data suggested that the nicotine might elicit dependence by altering the neuronal balance of proteasome subunits，with the MAPK cascade and ubiquitin-proteasome pathway playing a pivotal role.

differential proteomics；iTRAQ；nicotine；neuronal SH-SY5Y

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.012

2016-10-19

中國煙草總公司科技重點項目（110201402037）

朱貝貝，女，碩士研究生，研究方向：吸煙與健康及生物標志物；E-mail：beibeizhus@126.com

侯宏衛，男，研究員，研究方向：吸煙與健康及生物標志物；E-mail：qsfctc@163.com胡清源，男，研究員，研究方向：煙草化學研究及煙草質量監督檢驗；E-mail：huqy1965@163.com