周期素依賴性蛋白激酶—5在不同成年牛皮膚中的表達

劉晉冀+楊潔鴻

摘要：采用不同毛色的牛皮作為研究對象，運用免疫組織化學法對周期素依賴性蛋白激酶-5（CDK-5）在成年牛皮膚中的表達進行定位和定性研究。結果表明，CDK-5在牛皮膚毛囊的外根鞘和毛球部呈陽性表達，說明CDK-5可能與牛毛色形成有關。

關鍵詞：周期素依賴性蛋白激酶-5（CDK-5）；毛囊；毛色；免疫組織化學

中圖分類號：S823；Q344+.13 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2017）03-0005-02

周期素依賴性蛋白激酶-5（Cyclin dependent kinase 5，CDK-5）是CDKs家族的成員之一，屬于小絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，因為他具有與其他的CDK成員同源的序列而得名[1]。但CDK-5的功能卻不同于其他CDKs成員那樣參與細胞周期的調控，而是主要參與神經元正常功能的維持[2]。最初認為CDK-5僅在神經元中表達，但近年的研究發現CDK-5在非神經元的組織或細胞中廣泛表達并發揮作用。牛（Cattle）是中國傳統物種，也是非常常見的物種之一。牛作為經濟型大型哺乳動物，除了肉、奶等畜牧產品外，皮毛作為農業附屬品，也同樣具有研究價值。動物皮毛中的黑色素種類、數量以及分布情況決定其毛色的表達，其中酪氨酸酶（TYR）是黑色素合成過程中的關鍵酶，對毛色形成發揮至關重要的作用。其中酪氨酸羥化酶（TH）是TYR重要的激活因子之一，而TH酶的活性受細胞CDK-5的調控，因此CDK-5可能在毛色形成過程中發揮作用。哺乳動物的毛色受許多基因的控制，這些基因通過相互作用決定毛色的產生。研究CDK-5與牛毛色的關系，不僅會通過實踐操作對免疫組化有一個定性的認識，而且可以依據學術界先鋒對羊駝的毛色形成的研究作出假設，對CDK-5是否對所有動物的毛色形成有關系這一問題提供一個實例[3-8]。白色毛色是由于黑色素細胞數量較少，黑素體內黑色素含量也少，毛根中明顯缺乏黑色素細胞及其前體的緣故[9]。哺乳動物的皮膚和毛發色素沉著決定于其所含真黑色素與褐色素的相對數量[10，11]。因此，試驗對CDK-5在黑白兩色牛皮膚中的表達進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

選取黑白毛色的牛體側皮膚，剃毛后刮凈表皮，用取皮器取出黑白各2塊牛皮膚組織，置于4%的中性甲醛溶液中固定18 h，石蠟包埋，切片，進行免疫組織化學研究。

1.2 主要試劑及方法

兔抗人、大鼠、小鼠CDK-5多克隆抗體、HRP-山羊抗兔LgG、DAB顯色試劑盒（DB公司）；PBS緩沖液，正常兔血清，DAB顯色液，Triton試劑（聚乙二醇辛基苯基醚），無水乙醇，蘇木精染料，KD-BM生物組織包埋機、KD-2508切片機，HPP-9160電熱恒溫培養箱、HH-6數顯恒溫水浴鍋、Leica DMLB顯微鏡。組織包埋及切片制作免疫組織化學流程參照文獻[11]的方法。

1.3 免疫組化圖像分析

光鏡下觀察免疫組織化學切片，每頭牛取3張切片，每張切片用DP軟件采集5個視野，對染色結果用Image-ProPlus 6.0軟件進行圖像分析，進行陰陽性對照。

2 結果與分析

免疫組織化學染色結果顯示，CDK-5在白色和黑色牛皮膚毛囊的外根鞘和毛球部呈陽性表達，反應陽性物分布在胞質和細胞間質內，對照組未觀察到陽性細胞（圖1）。由圖1可知，在黑白兩色牛皮膚毛囊外根鞘和毛球部存在CDK-5陽性免疫反應物，預示了CDK-5在黑白兩色牛皮膚毛囊中發揮著某種生物學功能。

3 討論

本研究發現，在黑白牛皮膚毛囊外根鞘和毛球部存在CDK-5陽性免疫反應物，表明CDK-5在黑白兩色牛皮膚毛囊中發揮著某種生物學功能。皮膚毛囊外根鞘內含有大量的黑色素細胞，正常的黑色素細胞形態特點為核小和胞漿不明顯[12]，而毛球是產生生黑素細胞并直接向毛干輸送黑色素的惟一部位[13]。研究發現，CDK-5是一個能使體內外的酪氨酸羥化酶（TH）發生磷酸化的激酶[14]，TH在許多位點被不同的激酶磷酸化后不同程度地影響著TH酶的活性[15-17]。TH被CDK-5磷酸化后，TH的蛋白水平和活性均增加，如果缺少CDK-5，TH蛋白將不穩定，容易發生降解。TH是TYR的活性之一，而TYR是在黑色素合成的起始過程中的一種關鍵酶。

本研究結果顯示，黑白色牛皮膚中存在CDK-5基因和蛋白的表達量，與文獻觀點相結合，推測CDK-5與牛毛色的形成相關。然而，CDK-5在牛毛色形成調控過程中的作用和其功能的驗證還有待于進一步的研究，本試驗將為研究該基因與牛乃至其他哺乳動物毛色形成的關系提供一定的理論基礎。

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