過表達PGRN抑制LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷

尚立群， 張永慶， 苗 毅， 楊淑梅

(陜西省人民醫院呼吸內一科， 陜西 西安 710068)

過表達PGRN抑制LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷

尚立群△， 張永慶， 苗 毅， 楊淑梅

(陜西省人民醫院呼吸內一科， 陜西 西安 710068)

目的： 探討顆粒體蛋白前體(progranulin，PGRN)對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的人肺泡上皮A549細胞和HPAEpiC細胞增殖、凋亡及炎癥的影響。方法: 實驗分為4 組：對照(control)組為正常培養的細胞；LPS組用LPS(10 mg/L)處理；PGRN+LPS組在轉染pcDNA3.1-PGRN 質粒后加入LPS處理；pcDNA3.1+LPS組在轉染pcDNA3.1-EGFP質粒后加入LPS處理。MTT試劑盒檢測細胞活力；BrdU摻入實驗檢測細胞增殖；流式細胞術檢測細胞凋亡率；RT-qPCR和Western blot分別檢測PGRN的mRNA和蛋白表達；Western blot檢測caspase-3、Bcl-2、Bax、IL-1β、IL-6、TNF-α、p65和p-IκB-α的蛋白水平。結果: 與對照組相比，LPS組的細胞增殖率下降(P<0.05)，凋亡率上升(P<0.05)，caspase-3和Bax的蛋白表達上調(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表達下調(P<0.05)，IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達上調(P<0.05)，p65和p-IκB-α的蛋白水平增加(P<0.05)，與LPS組相比，PGRN+LPS組的細胞增殖率上升(P<0.05)，凋亡率下降(P<0.05)，caspase-3和Bax的蛋白表達下調(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表達上調(P<0.05)，IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達下調(P<0.05)，p65和p-IκB-α的蛋白水平降低(P<0.05)。結論: PGRN過表達可以減輕LPS誘導的A549細胞和HPAEpiC細胞增殖、凋亡異常及炎癥因子產生等損傷，這可能與PGRN參與調控NF-κB信號通路有關。

顆粒體蛋白前體； 脂多糖； 肺泡上皮細胞； 細胞增殖； 細胞凋亡； NF-κB信號通路

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)/成人呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由多種致病因素(如創傷、感染、缺血/再灌注、燒傷等)導致的一種嚴重的炎癥綜合征，病死率高達50%～70%，病理特征主要為肺泡上皮細胞的急性損傷[1]。因此, 作為肺上皮屏障，肺泡上皮細胞是否能得到有效的修復是治療ALI/ARDS的關鍵。顆粒體蛋白前體(progranulin，PGRN)是由 593個氨基酸組成的多功能的生長因子，表達于多種組織及快速增殖的細胞中，包括上皮細胞、神經細胞、巨噬細胞、軟骨細胞以及免疫細胞等[2]，在組織損傷修復、腫瘤發生、神經退行性病變等方面發揮重要的作用[2-5]。大量的研究表明，PGRN能通過調節不同的信號通路，在類風濕性關節炎、炎癥性腸病、銀屑病等多種炎癥性疾病中發揮重要的抗炎作用，但其對肺泡上皮細胞損傷是否起保護作用尚不清楚。內毒素(lipopolysaccharide，LPS)是存在于革蘭陰性細菌細胞壁外膜中以脂多糖為主的成分，可以引起ALI/ARDS[6-7]，所以本研究采用LPS誘導A549細胞和HPAEpiC細胞，探討PGRN過表達對肺泡上皮細胞損傷的影響及作用機制。

材 料 和 方 法

1 藥品、試劑和主要設備

脂多糖(Sigma)；Lipofectamine 2000(Invitrogen)；DMEM 培養基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和胰蛋白酶(Gibco)；Trizol(Invitrogen)；逆轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq mixture(TaKaRa)；RIPA 細胞裂解液、PMSF、核蛋白抽提試劑盒和BCA 蛋白含量測定試劑(碧云天生物技術研究所)；抗caspase-3、Bcl-2、Bax、IL-1β、IL-6、TNF-α和GAPDH等 I 抗抗體(Santa Cruz)；抗PGRN、p65和p-IκB-α等 I 抗抗體(Millipore)；II抗抗體(Pierce)；MTT檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物有限公司)；5-溴-2’-脫氧尿苷(5-bromo-2’-deoxyuridine， BrdU; Sigma)；抗BrdU抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；ELISA法IL-1β、IL-6和TNF-α檢測試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。細胞培養箱(Thermo Fisher Scientific)；7300實時PCR擴增系統(Applied Biosystem)；Western blot設備、酶聯免疫檢測儀購自(Bio-Raid)；流式細胞儀(BD)。

2 方法

2.1 細胞培養及LPS處理 人肺泡上皮細胞A549為本實驗室保存細胞株，人肺上皮細胞株 HPAEpiC 購自ATCC。均用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基，培養在5% CO2、37 ℃培養箱中。當細胞融合到80%～90%的時候，用0.25%(含EDTA)的胰酶進行消化傳代。將細胞接種于培養板, 在對數生長期加入LPS，使其終濃度為10 mg /L，處理24 h后收集細胞。

2.2 細胞轉染 pcDNA3.1-EGFP載體為本實驗室保留。通過PCR擴增人的全長PGRN cDNA，然后將其連接到pcDNA3.1-EGFP載體中，得到pcDNA3.1-PGRN(含EGFP)載體。當細胞融合率達到60%后，用Lipofectamine 2000將pcDNA3.1-PGRN或pcDNA3.1-EGFP分別轉染到細胞中。6 h后，原培養基更換為新的培養基，繼續培養24 h。隨后用LPS處理細胞24 h用于后續實驗。

2.3 實驗分組 實驗分為4組：對照(control)組,為正常培養的細胞；LPS組,用LPS(10 mg /L)處理24 h的細胞；PGRN+LPS組,細胞經轉染pcDNA3.1-PGRN質粒24 h后，加入LPS處理24 h；pcDNA3.1+LPS組,細胞經轉染pcDNA3.1-EGFP質粒24 h后，加入LPS處理24 h。

2.4 RT-qPCR實驗 根據Trizol試劑說明書提取各組細胞總RNA，并測試RNA濃度和純度。參照逆轉錄試劑盒說明書將2 μg RNA逆轉成cDNA，以cDNA為模板檢測PGRN的mRNA 水平。PGRN的上游引物序列為5’-GGACAGTACTGAAGACTCTG-3’，下游引物序列為5’-GGATGGCAGCTTGTAATGTG-3’。PCR 擴增體系為20 μL，包括10 μL 2×的SYBR Premix Ex Taq mixture，0.2 μmol /L的引物，2 μL的2倍稀釋的cDNA 和RNA-free ddH2O。反應程序如下：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，36個循環。以β-actin作為內參照，采用2-ΔΔCt法比較分析各組mRNA 水平的變化。

2.5 Western blot實驗 使用含有1% PMSF的RIPA裂解液提取各組細胞的總蛋白，BCA 蛋白試劑盒檢測蛋白濃度。取適量樣品進行SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后將總蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h后，分別加入抗PGRN、caspase-3、Bcl-2、Bax、IL-1β、IL-6、TNF-α、p-IκB-α和GAPDH等 I 抗4 ℃孵育過夜，洗膜5 min×3次；加入相應 II 抗室溫孵育2 h，洗膜5 min×4次。經Odyssey紅外激光成像系統掃描，以GAPDH作為內參照，灰度分析目的蛋白/GAPDH的相對表達量。用核蛋白抽提試劑盒提取各組細胞核蛋白，同上述方法檢測核內p65的表達水平。

2.6 MTT法檢測細胞活力 將細胞接種于96孔板，分別根據細胞分組作不同處理，每孔加入5 g/L MTT溶液10 μL，37 ℃孵育4 h。隨后棄上清，每孔中加入100 μL的DMSO并輕輕震蕩10 min使其充分溶解。酶聯免疫檢測儀檢測570 nm波長下的吸光度(A)。

2.7 BrdU 摻入實驗 將細胞接種于置有蓋玻片的24 孔板上，分別根據細胞分組作不同處理，在處理后的每孔中加入10 μmol/L BrdU，孵育2 h。然后經4%多聚甲醛固定后，用BrdU抗體在37 ℃孵育2 h，再用熒光 II 抗孵育1 h。最后用DAPI 染細胞核后，激光共聚焦顯微鏡下觀察。隨機選擇5個視野，計算BrdU陽性(BrdU+)細胞數，取平均值。BrdU+細胞比例=紅色熒光細胞數/總細胞數。

2.8 流式細胞術檢測細胞凋亡 用0.25%胰酶(不含EDTA)消化各組細胞，離心收集。PBS洗滌細胞2次(離心1 000 r/min，5 min)。加入100 μL 1×結合緩沖液吹打懸浮細胞后，分別加入5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI染色，輕輕搖勻后置室溫閉光孵育15 min。每管再加入400 μL 1×結合緩沖液，于1 h內上流式細胞儀檢測。

2.9 ELISA檢測細胞培養上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平 將細胞接種于6孔板，根據細胞分組作不同處理后，收集細胞，1 000×g離心10 min，取上清液，-20 ℃保存。用ELISA試劑盒說明書步驟分別檢測IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

3 統計學處理

每組實驗均重復至少3次，計量資料數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示。用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計分析，各組間差異比較采用單因素方差分析，以P<0.05為有差異有統計學意義。

結 果

1 PGRN的過表達

用Western blot和RT-qPCR方法檢測LPS誘導細胞中以及轉染過表達PGRN質粒后PGRN的表達變化，可見A549細胞和HPAEpiC細胞的檢測結果一致，與對照組相比，LPS組PGRN的mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05)。與LPS組相比，PGRN+LPS組PGRN的mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.05)，而pcDNA3.1+LPS組PGRN的mRNA和蛋白水平無顯著變化，見圖1。

Figure 1.The expression of PGRN in the A549 cells (A, B) and HPAEpiC cells (C， D). A, D: the mRNA levels of PGRN were detected by RT-qPCR; B, D: the protein levels of PGRN were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

圖1 PGRN在A549和HPAEpiC細胞中的表達

2 PGRN過表達促進肺泡上皮細胞增殖

MTT實驗和BrdU摻入實驗檢測PGRN過表達對LPS誘導的細胞活力和增殖的影響。A549細胞和HPAEpiC細胞的檢測結果一致，與對照組相比，LPS組的細胞活力和增殖率顯著下降(P<0.05)。與LPS組相比，PGRN+LPS組的細胞活力和增殖率顯著升高(P<0.05)，而pcDNA3.1+LPS組的細胞活力和增殖率無顯著變化，見圖2。

Figure 2.PGRN overexpression promoted the proliferation in LPS-induced A549 cells (A, B) and HPAEpiC cells (C, D). A, C: the cell viability was detected by MTT assay; B, D: the cell proliferation was assessed by BrdU incorporation assay. The proliferating cells were BrdU+cells as indicated by arrows. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

圖2 PGRN過表達促進肺泡上皮細胞增殖

3 PGRN過表達抑制LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡

為了檢測PGRN過表達對LPS誘導的細胞凋亡的影響，流式細胞儀分析各組細胞的凋亡水平。A549細胞和HPAEpiC細胞中結果一致，與對照組相比，LPS組的凋亡率顯著增加(P<0.05)。PGRN+LPS組的凋亡率與LPS組相比顯著降低(P<0.05)，見圖3。

4 PGRN過表達對LPS誘導的凋亡相關蛋白的影響

為了檢測PGRN過表達對LPS誘導的細胞凋亡的影響，我們進一步用Western blot方法檢測了凋亡相關蛋白的表達水平。A549細胞和HPAEpiC細胞的檢測結果一致，與對照組相比，LPS組caspase-3和Bax的蛋白水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2的蛋白水平顯著降低(P<0.05)。與LPS組相比，過表達PGRN顯著下調caspase-3和Bax的蛋白水平(P<0.05)，顯著上調Bcl-2的蛋白水平(P<0.05)，見圖4。

5 PGRN過表達抑制LPS誘導的炎癥因子表達

為了檢測PGRN過表達對LPS誘導的炎癥因子表達的影響，我們用ELISA和Western blot方法檢測了IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平。A549細胞和HPAEpiC細胞的檢測結果一致，與對照組相比，LPS處理顯著上調IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平(P<0.05)。與LPS組相比，PGRN+LPS組IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平下降，且差異具有顯著性(P<0.05)，見圖5。

6 PGRN過表達抑制NF-κB信號通路

為了檢測PGRN過表達對LPS誘導的NF-κB信號通路的影響，我們用Western blot方法檢測了p65和p-IκB-α的蛋白水平。A549細胞和HPAEpiC細胞的檢測結果一致，與對照組相比，LPS組p65和p-IκB-α的蛋白水平顯著上調(P<0.05)；與LPS組相比，PGRN+LPS組p65和p-IκB-α的蛋白水平顯著下調(P<0.05)，見圖6。

Figure 3.PGRN overexpression inhibited LPS-induced cell apoptosis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

圖3 PGRN過表達抑制LPS誘導的細胞凋亡

Figure 4.The effects of PGRN overexpression on the levels of apoptosis-related proteins. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

圖4 PGRN過表達影響LPS誘導的凋亡相關蛋白的表達

討 論

ALI/ARDS是多種病因所致的一種急性呼吸衰竭，其發病率和病死率居高不下。ALI/ARDS的發病機制至今尚不明確，其核心病變表現為肺泡上皮細胞的損傷。肺泡Ⅱ型上皮細胞可分化為Ⅰ型上皮細胞，合成分泌肺泡表面活性物質，參與氧化代謝，作為某些激素的靶細胞等多種生物學功能[8]，其功能特性決定了研究肺泡Ⅱ型上皮細胞的損傷機制在ALI/ ARDS的治療和預防中具有重要的意義。大量研究表明，PGRN不但能夠調節機體正常的發展，在增殖、凋亡及炎癥反應等多種病理生理過程都發揮重要的作用。近期研究表明，PGRN能夠減輕LPS誘導的ALI模型小鼠的肺損傷，說明PGRN可能是治療和預防ALI/ARDS的一個重要靶基因[9]。本研究發現，在LPS誘導的A549細胞和HPAEpiC細胞中，PGRN 的 mRNA 和蛋白質表達水平均顯著降低，說明PGRN過表達可能能夠減輕LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷。本研究通過轉染 pcDNA3.1-PGRN 質粒，探討PGRN過表達對LPS誘導的A549細胞和HPAEpiC細胞損傷的影響及調控機制。

Figure 5.PGRN overexpression inhibited the production of inflammatory factors in A549 cells (A, B) and HPAEpiC cells (C, D). A, C: the concentrations of IL-1β, IL-6 and TNF-α in the cell culture supernatant were measured by ELISA; B, D: the protein levels of L-1β, IL-6 and TNF-α were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

圖5 PGRN過表達抑制LPS誘導的炎癥因子的產生

Figure 6.PGRN overexpression inhibited LPS-induced NF-κB signaling activation. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

圖6 PGRN過表達抑制LPS誘導的NF-κB通路的激活

有研究表明，肺泡Ⅱ型上皮細胞的快速增殖是保持肺泡連續性，維護屏障功能和限制氣道高反應性的關鍵因素。若其增生活躍，肺泡壁能迅速得以修復，重建肺泡上皮功能[10]。PGRN作為一種生長因子，能促進細胞增殖，并在快速生長的上皮細胞、內皮細胞、腫瘤細胞的生長發育中起著至關重要的作用[11]。本研究結果表明，LPS處理減緩A549細胞和HPAEpiC細胞的增殖，而PGRN過表達能夠顯著促進細胞增殖。臨床和動物實驗表明，在ALI發生的不同時期均有細胞凋亡現象，細胞過度凋亡將會加重ALI的病理變化[12]。氣管內注入LPS致ALI小鼠損傷后6 h即可檢測到凋亡的肺泡上皮細胞[13]。本研究表明，LPS誘導A549和HPAEpiC細胞凋亡，而PGRN過表達能夠顯著抑制LPS誘導的細胞凋亡。以上結果說明PGRN過表達能夠緩解LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。Caspase-3的激活被認為是不同途徑引起凋亡的共同通路。Bcl蛋白家族，包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax, 都是線粒體凋亡通路的經典標記分子。我們發現，PGRN過表達顯著抑制LPS誘導的caspase-3和Bax的表達，同時能夠上調Bcl-2的水平，說明PGRN抑制LPS誘導的肺泡上皮細胞凋亡，可能是通過抑制線粒體凋亡通路而發揮作用。

炎癥反應也是ALI中內環境紊亂的一個重要因素。在LPS引發ALI的肺灌洗液中，伴有顯著的中性粒細胞浸潤，而且促炎因子表達增加。有研究表明，PGRN在LPS誘導的小鼠ALI中發揮重要的抗炎作用。PGRN能顯著抑制小鼠體質量減輕，降低死亡率，并呈劑量依賴性地降低促炎因子的表達[9]。我們的實驗結果表明，與對照組相比，LPS組的IL-1β、IL-6和TNF-α的表達顯著上調，說明LPS誘導了A549細胞和HPAEpiC細胞的炎癥反應。當過表達PGRN后，發現與LPS組相比，IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平顯著降低，說明 PGRN過表達可以降低LPS誘導的A549細胞和HPAEpiC細胞中的炎癥反應。Tang等[14]研究表明，PGRN作為腫瘤壞死因子受體 (tumor necrosis factor receptor，TNFR) 的一種新配體，通過與TNF-α競爭TNFR1/2[15]而拮抗TNF-α介導的NF-κB 等信號通路，在類風濕性關節炎等多種疾病中發揮抗炎作用。大量實驗結果表明，NF-κB在ALI發病機制中發揮關鍵性作用[16]，作為轉錄因子參與機體的炎癥反應、細胞凋亡等應激反應，從而導致肺泡細胞損傷。本文研究結果顯示，PGRN過表達抑制LPS誘導的NF-κB信號通路的激活，說明PGRN可能通過調控NF-κB信號通路緩解LPS誘導的肺泡上皮細胞損傷。

綜上所述，本研究表明PGRN 過表達能夠緩解LPS誘導的A549細胞和HPAEpiC細胞增殖凋亡異常、炎性因子產生等損傷，提示PGRN可能是參與調控肺泡上皮細胞生理功能的重要因子。深入研究 PGRN在LPS誘導的肺泡上皮細胞中的作用及作用機制，有助于更深入地了解ALI/ARDS的發病機制，并為治療ALI/ARDS提供新的思路。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

PGRN over-expression inhibits LPS-induced alveolar epithelial cell injury

SHANG Li-qun, ZHANG Yong-qing, MIAO Yi, YANG Shu-mei

(DepartmentofRespiratoryMedicine,ShaanxiProvincialPeople’sHospital,Xi’an710068,China.E-mail:shangliqunslq@163.com)

AIM: To investigate the effects of progranulin (PGRN) on the proliferation, apoptosis and inflammatory responses in lipopolysaccharide (LPS)-induced human alveolar epithelial A549 cells and HPAEpiC cells.METHODS: The cells were divided into 4 groups: control group (the normal cultured cells), LPS group [the cells were treated with LPS (10 mg/L)]， PGRN+LPS group (the cells were transfected with pcDNA3.1-PGRN plasmids and then treated with LPS)， and pcDNA3.1+LPS group (the cells were transfected with pcDNA3.1-EGFP plasmids and then treated with LPS). The cell viability was measured by MTT assay, cell proliferation was measured by BrdU incorporation assay, and cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The expression of PGRN at mRNA and protein levels was detected by RT-qPCR and Western blot. The protein levels of caspase-3, Bcl-2, Bax, IL-1β, IL-6, TNF-α, p65 and p-IκB-α were determined by Western blot. RESULTS: Compared with control group, the cell proliferation rate was decreased (P<0.05), and the apoptotic rate was increased (P<0.05) in LPS group. The protein levels of caspase-3 and Bax were significantly up-regulated (P<0.05)， and the expression of Bcl-2 was down-regulated (P<0.05). The protein levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α were significantly up-regulated (P<0.05), and the protein levels of p65 and p-IκB-α were enhanced (P<0.05). Compared with LPS group, the cell proliferation rate was increased (P<0.05), and the apoptotic rate was decreased (P<0.05) in PGRN+LPS group. The protein levels of caspase-3 and Bax were significantly down-regulated (P<0.05), and the expression of Bcl-2 was up-regulated (P<0.05). The protein levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α were significantly down-regulated (P<0.05), and the protein levels of p65 and p-IκB-α were decreased (P<0.05). CONCLUSION: PGRN over-expression may alleviate LPS-induced abnormal proliferation, apoptosis and inflammatory cytokine production in the A549 cells and HPAEpiC cells, which may be associated with the regulation of NF-κB signaling pathway.

Progranulin; Lipopolysaccharide; Alveolar epithelial cells; Cell proliferation; Apoptosis; NF-κB signaling pathway

1000- 4718(2017)05- 0877- 07

2016- 09- 18

2017- 02- 16

R563.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.018

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