CCR5第一、二胞外環(huán)特異性結合的拮抗短肽對TNBS誘導SD大鼠結腸炎的治療作用*

胡 梅， 宋楊達▲， 劉思雪， 宋銥航， 沈溪明， 黃花榮， 鐘英強△

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院 1消化內科， 2病理科， 3兒科， 廣東 廣州 510120)

CCR5第一、二胞外環(huán)特異性結合的拮抗短肽對TNBS誘導SD大鼠結腸炎的治療作用*

胡 梅1， 宋楊達1▲， 劉思雪1， 宋銥航1， 沈溪明2， 黃花榮3△， 鐘英強1△

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院1消化內科，2病理科，3兒科， 廣東 廣州 510120)

目的： 研究C-C趨化因子受體5(CCR5)膜外第一、二胞外環(huán)(ECL1和ECL2)特異性結合的拮抗短肽對三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的結腸炎模型大鼠的治療作用與機制。方法: 采用100 mg/kg TNBS誘導結腸炎SD大鼠模型；用不同劑量的2條拮抗短肽(ECL1： 25、35和45 mg/kg； ECL2：15、25和35 mg/kg)分別作用于模型大鼠，觀察其對大鼠疾病活動指數(shù)(DAI)、結腸大體損傷指數(shù)(CMDI)和組織病理學改變的影響，采用real-time PCR和Western blot法分別檢測結腸組織TNF-α和COX-2的mRNA與蛋白表達水平。結果: 與模型組相比，有效劑量的ECL2拮抗短肽HY治療組大鼠疾病活動程度、腸道潰瘍及病理組織學損傷均有明顯減輕，各評分指數(shù)差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TNF-α和COX-2的蛋白和mRNA表達水平均明顯下降(P<0.05)。ECL1拮抗短肽GH作用的大鼠結腸炎癥狀評分及TNF-α和COX-2炎癥因子表達無明顯改變。結論: ECL2拮抗短肽可能通過下調結腸黏膜TNF-α 和COX-2的表達來緩解TNBS誘導的SD大鼠結腸炎，而ECL1拮抗短肽的作用不明顯。

C-C趨化因子受體5； 拮抗肽； 炎癥性腸病

近年來，我國炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)發(fā)病率有逐年上升的趨勢。C-C趨化因子受體5(C-C chemokine receptor 5，CCR5)是一種G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)，與配體結合后通過調節(jié)多種炎癥細胞在體內的遷移與定位，參與多種免疫性疾病的發(fā)病機制。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，IBD與CCR5關系密切[1-2]；CCR5主要表達在腸黏膜固有層炎性細胞、固有腺體上皮細胞和血管內皮細胞的胞漿或胞膜上[3]。我們還通過噬菌體展示肽庫技術淘選與大鼠CCR5特異性結合的活性短肽并進行了體外功能的初步鑒定[4]。在此基礎上，本實驗進一步研究CCR5膜外第一、二胞外環(huán)特異性結合的活性短肽(GH和HY)對三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)誘導的SD大鼠結腸炎的治療作用與機制。

材 料 和 方 法

1 動物

健康成年雌性Sprague-Dawley (SD)大鼠，體重(200±10) g，6～7周齡，購買并飼養(yǎng)于中山大學實驗動物中心。飼養(yǎng)條件為SPF級。本項目經中山大學實驗動物管理與使用委員會以及實驗動物倫理委員會的批準。

2 主要試劑與儀器

CCR5的2條模擬短肽[5]由吉爾生化有限公司合成，純度為95%； 5% (W/V) TNBS購自Sigma，與無水乙醇按1∶1體積配成灌腸液；糞便隱血試劑盒(雙聯(lián)法)購自珠海貝索生物技術有限公司；TRIzol? RNA 提取試劑、Premix Taq PCR試劑盒及real-time PCR試劑盒均購自TaKaRa；BCA-100法蛋白質定量測定試劑盒和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒均購自上海碧云天生物醫(yī)學研究所；兔抗鼠TNF-α抗體購自Novus；兔抗鼠COX-2抗體購自CST；HRP標記羊抗鼠 II 抗購自武漢谷歌生物科技有限公司；LightCycler 480 Real-Time PCR System為Roche產品。

3 主要方法

3.1 TNBS誘導SD大鼠結腸炎模型的構建 SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周，正常自由飲食。大鼠結腸炎模型的誘導方法參照文獻[5]稍加改動，具體方法為：大鼠禁食不禁水24 h，稱質量后10%水合氯醛(0.03 mL/kg)腹腔麻醉，用16號大鼠灌胃針將灌腸液緩慢灌入大鼠結腸末端(距肛門端約8 cm)，繼續(xù)保持大鼠倒立姿勢30 min，仰臥歸籠，自然蘇醒，自由飲食。

3.2 TNBS造模劑量的篩選 選取27只SD大鼠，分4組，正常組3只，造模組每組8只，依照文獻[5]的TNBS造模劑量，選取80 mg/kg、100 mg/kg和120 mg/kg的灌腸液劑量造模，根據(jù)大鼠疾病活動指數(shù)評分及死亡率篩選TNBS建立炎癥性腸病的最佳造模劑量，再利用最適劑量建模并進行后續(xù)研究。

3.3 CCR5兩條模擬短肽干預實驗的分組給藥 選取40只SD大鼠，每組5只，分為正常對照組(normal組)、TNBS/乙醇造模組(model組)、TNBS/乙醇造模+GH短肽治療組(GH組)和TNBS/乙醇造模+HY短肽治療組(HY組)。在造模后第3天治療組大鼠分別予以GH短肽和HY短肽尾靜脈注射治療，模型組大鼠尾靜脈給予等體積的無菌PBS溶液注射，每天1次，連續(xù)7 d(至造模后第9天)。其中，2個短肽給藥組分別設立3個濃度梯度，GH短肽治療組為25 mg/kg、35 mg/kg和45 mg/kg，HY短肽治療組為15 mg/kg、25 mg/kg和35 mg/kg。經疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)、結腸大體損傷指數(shù)(colon macroscopic damage index， CMDI)及組織學分級結果選擇最適有效給藥濃度。隨后，對最適給藥濃度組大鼠結腸組織行TNF-α和COX-2的mRNA及蛋白表達水平測定。

3.4 大鼠DAI評分 每天記錄大鼠的體重下降程度、大便性狀(正常、稀便或腹瀉)以及糞便潛血或便血進行DAI評分，DAI為體重下降分數(shù)、糞便性狀分數(shù)和隱血分數(shù)三者之和的平均數(shù)，具體方法參照文獻[6](表1)進行。糞便潛血通過匹拉米洞化學法檢測。

表1 疾病活動指數(shù)

DAI = (combined score of weight loss, stool consistency and bleeding)/3.*Normal stools: well-formed pellets; loose: pasty stools which do not stick to the anus; diarrhea: liquid stools that stick to the anus.

3.5 大鼠CMDI評分 造模后第21天，用10%水合氯醛(0.06 mL/kg)腹腔過量麻醉處死大鼠。取大鼠結腸沿腸系膜打開，用預冷生理鹽水沖洗掉糞便，清理粘連組織。對各組結腸進行CMDI評分，該評分包括結腸和周圍組織的粘連程度、潰瘍及炎癥的嚴重程度，具體方法參照文獻[7](表2)進行。

表2 結腸大體形態(tài)損傷指數(shù)

3.6 大鼠結腸炎的組織學分級評分 大體損傷評分后，迅速取炎癥最嚴重的結腸組織，用4%的多聚甲醛固定，5 mm切片后HE染色。每張結腸切片隨機選取10個100倍的鏡下視野，按照文獻[8](表3)組織學損傷評分標準進行評分。其中，每個視野的“炎癥、深度、隱窩損傷或再生”程度評分后，乘以各自的累及范圍，得出各項評分(即炎癥和深度評分范圍是0～12分，再生或隱窩損傷評分范圍是0～16分)，最終組織學評分為各部分之和。

3.7 Real-time PCR法檢測結腸組織TNF-α 和COX-2的mRNA表達水平 采用TRIzol法提取結腸組織總RNA。參照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，合成cDNA，用cDNA模板1 μL對大鼠內參照β-actin、COX-2及TNF-α(具體引物序列見表4)分別進行PCR擴增。反應體系含1 μL cDNA、5 μL 2×Premix Type試劑、0.4 μL上游引物和0.4 μL下游引物，無菌雙蒸水補足至10 μL。PCR儀擴增參數(shù)為： 95 ℃ 30 s， 95 ℃5 s， 60 ℃ 20 s， 40個循環(huán)。實時熒光定量PCR 反應結束后，電腦自動分析熒光信號并將其轉換為COX-2和TNF-α的起始拷貝數(shù)及循環(huán)閾值(Ct)。最后，用2-ΔΔCt方法計算各個基因表達的相對變化[9]。

3.8 Western blot法檢測結腸組織TNF-α和COX-2的蛋白表達水平 將結腸組織稱重，按1∶4的比例加入細胞裂解液，冰上勻漿，裂解30 min后，4 ℃下14 000×g離心5 min取上清，用BCA比色法按說明書操作檢測樣品蛋白濃度，并計算60 μg所需的上樣體積。樣品加入SDS上樣緩沖液混勻后加熱5 min使蛋白變性，進行SDS-PAGE(恒壓60 V～110 V，約2.5 h)，用PDVF膜進行電轉膜(恒流250 mA，90 min)，用50 g/L脫脂奶粉封閉液封閉1 h，后分別加入抗COX-2(1∶1 000)、β-actin(1∶1 500)和TNF-α(1∶1 000)的單抗4 ℃孵育過夜，用TBST洗膜10 min×3次后，加入 II 抗(1∶3 000)孵育1 h，用TBST洗膜10 min×3次，使用電腦凝膠成像系統(tǒng)曝光。采用ImageJ軟件，對每組COX-2和TNF-α與β-actin積分吸光度的比值進行半定量分析。

表3 結腸炎的組織學分級

表4 引物序列

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 12.0數(shù)據(jù)分析軟件進行統(tǒng)計。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 TNBS建立結腸炎大鼠的最適造模劑量

120 mg/kg TNBS造模組在第5、6天各死亡1只，在第10天死亡2只，死亡率達50%，造模后大鼠少動，精神萎靡、無進食等，體質量顯著下降，持續(xù)6～10 d，血樣黏液便可持續(xù)7～9 d，實驗結束見大便潛血，平均DAI評分約為2，該劑量組模型鼠癥狀過重且死亡率過高。100 mg/kg TNBS造模組在第14天死亡1只，造模后大鼠抱團、少動、進食少等，體重持續(xù)下降5～7 d，血樣黏液便可持續(xù)3～6 d，大便潛血可持續(xù)9～14 d。80 mg/kg TNBS造模組，在第10天死亡1只，造模后大鼠精神稍差，懶動，部分大鼠于造模后第6天恢復到造模前體重，部分大鼠造模后無明顯血便，部分造模后第6天大便潛血即為陰性，實驗結束時平均DAI評分約為0.33，該劑量組模型鼠結腸炎癥狀偏輕且持續(xù)時間過短。因此，100 mg/kg為TNBS建立結腸炎大鼠的最適造模劑量，見圖1。

Figure 1.The DAI in groups with different doses of TNBS. Mean±SEM.n=8.

圖1 不同TNBS劑量組的疾病活動指數(shù)評分

2 CCR5拮抗短肽對疾病活動指數(shù)的影響

結腸炎大鼠經2條短肽治療后，HY拮抗短肽組的DAI評分在造模后第6天均較model組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療后大鼠糞便恢復正常的時間比model組提前。而GH拮抗短肽組與模型組在第6、10、21天DAI評分比較，差異均無統(tǒng)計學顯著性，見表5。

3 CCR5拮抗短肽對大體形態(tài)損傷指數(shù)的影響

與model組相比，HY2組的CMDI顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，該組大鼠結腸肉眼可見炎癥損傷明顯減輕，潰瘍面積縮小，并可見愈合瘢痕。GH短肽組的潰瘍病變則均無明顯改善，與model組比較，CMDI差異均無統(tǒng)計學顯著性，見圖2、表6。

表5 GH短肽和HY短肽對結腸炎大鼠疾病活動指數(shù)評分的影響

Table 5.The effects of GH peptide and HY peptide on the DAI in the colitis rats (Mean±SEM.n=5)

GroupDaysafterTNBSenema61021Model2.27±0.161.07±0.160.47±0.13GH1(25mg/kg)2.00±0.211.20±0.130.67±0.00GH2(35mg/kg)1.40±0.070.67±0.000.20±0.13GH3(45mg/kg)1.80±0.251.07±0.160.40±0.16HY1(15mg/kg)1.53±0.13*0.80±0.130.13±0.13HY2(25mg/kg)1.46±0.13*0.67±0.130.07±0.13HY3(35mg/kg)1.60±0.68*0.93±0.160.20±0.13

*P<0.05νsmodel group.

Figure 2.The pathological changes of the colons in each group.

圖2 各組結腸肉眼變化

4 CCR5拮抗短肽對組織學損傷評分的影響

與模型組相比，HY2組的病理學評分差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；余下各劑量組及GH組的病理學評分差異則無統(tǒng)計學顯著性。病理見模型組結腸組織內大量炎癥細胞浸潤, 甚至累及全層，上皮部分壞死脫落，黏膜腺體減少，黏膜下層結構疏松水腫明顯，HY2短肽結腸組織炎癥細胞浸潤明顯減少，黏膜下層結締組織稍疏松，結腸組織處于完全自身修復狀態(tài)，GH2短肽結腸組織仍可見明顯炎癥細胞浸潤,腺體紊亂數(shù)量減少，見圖3、表6。

Figure 3.Histological changes of colonic mucosa in each group (×100).

圖3 各組結腸黏膜組織學改變

表6 GH短肽和HY短肽對結腸大體損傷指數(shù)和組織學評分的影響

Table 6.The effects of GH peptide and HY peptide on CMDI and histological scores in different groups (Mean±SEM.n=5)

GroupCMDIHistologicalscoreModel5.60±0.7530.92±5.47GH1(25mg/kg)5.00±0.4518.25±4.92GH2(35mg/kg)4.80±0.4910.93±3.79GH3(45mg/kg)7.00±0.7127.56±6.47HY1(15mg/kg)3.80±1.2415.32±5.41HY2(25mg/kg)2.00±0.32*7.33±1.45*HY3(35mg/kg)4.80±0.7425.48±5.15

*P<0.05vsmodel group.

5 CCR5拮抗短肽對結腸黏膜COX-2和TNF-α mRNA和蛋白表達的影響

由表7可見，模型組COX-2和TNF-α的mRNA表達水平較正常組明顯升高；HY2短肽干預組中COX-2和TNF-α的mRNA表達水平與模型對照組相比明顯下調，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；且HY2拮抗肽組和正常組比較差異無統(tǒng)計學顯著性，GH2短肽干預組與模型組比較差異也無統(tǒng)計學顯著性。

模型組COX-2和TNF-α蛋白表達水平和正常對照組比較明顯升高；HY短肽干預組中的COX-2和TNF-α蛋白表達水平與模型組相比明顯下調，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且與正常組比較差異無統(tǒng)計學顯著性。而GH短肽干預組與模型組比較差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖4、表7。

表7 COX-2 和TNF-α mRNA和蛋白表達量的比較

Table 7.The expression of COX-2 and TNF-α at mRNA and protein levels determined by RT-qPCR and Western blot (Mean±SEM.n=5)

GroupmRNAProteinCOX-2TNF-αCOX-2TNF-αNormal110.40±0.060.39±0.06Model4.90±0.12#2.19±0.21#0.77±0.06#0.86±0.06#GH2(35mg/kg)4.59±0.101.73±0.220.52±0.030.62±0.13HY2(25mg/kg)3.57±0.39*1.39±0.18*0.36±0.04*0.39±0.12*

#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsmodel group.

Figure 4.The images of Western blot for determining the protein expression of COX-2 and TNF-α.

圖4 Western blot檢測COX-2和TNF-α的蛋白表達

討 論

CCR5是一種由7次跨膜螺旋區(qū)、胞外長N末端、3個胞外環(huán)(ECL1-3)、3個胞內環(huán)(ICL1-3)和胞內C末端幾個部分構成的蛋白，其與配體調解活化正常T細胞表達和分泌因子(regulated upon activation normal T cell expression and secrete, RANTES)、巨噬細胞炎癥蛋白(macrophage inflammatory protein, MIP)-1α、MIP-1β等結合后通過調節(jié)炎癥細胞的活化和定向遷移來控制免疫和炎癥反應，從而參與IBD的發(fā)生與發(fā)展。在各免疫性疾病的發(fā)病機制中CCR5主要通過PKC、NF-κB、JAK-STAT等多條信號通路，促進T細胞增殖，上調多種細胞因子受體表達，促進炎癥反應。另外，CCR5是HIV-1感染靶細胞的輔助受體，CCR5拮抗劑也因此成為抗艾滋病藥物研發(fā)熱點，目前以CCR5為靶點的拮抗劑主要分趨化因子衍生物、非肽類小分子化合物、單克隆抗體及肽類化合物等4類，本實驗使用的親和短肽即屬于肽類拮抗劑一類，具有高活性、高穩(wěn)定性、高親和力和特異性結合的特點。因此說明CCR5拮抗短肽作為受體蛋白拮抗劑，可以干預CCR5介導的多種炎癥通路反應，發(fā)揮治療作用。已有研究者使用CCR5拮抗劑Met-RANTES、MIP-3α單克隆抗體以及TAK-779等分別治療實驗動物結腸炎，發(fā)現(xiàn)其可有效地抑制腸道炎癥反應、減輕腸道損傷[10-13]。

TNF-α是炎癥性腸病中公認存在的一種促炎因子，在結腸炎活動期，血液及炎癥性腸組織中TNF-α的水平明顯升高，介導腸黏膜損傷，臨床上抗TNF-α藥物在IBD的治療中也起到重要作用[14]。同樣COX-2/NF-κB也是炎癥性腸病發(fā)病機制中重要的炎癥通路，參與IBD的發(fā)展[15]。COX-2和TNF-α表達水平是許多研究治療IBD藥物的觀察指標[16]，它們在IBD中通過抑制NF-κB介導的促炎介質(COX-2、TNF-α等)發(fā)揮腸道抗炎作用[17]。

本實驗中，CCR5膜外第二環(huán)特異結合的拮抗短肽能明顯降低結腸炎大鼠疾病活動指數(shù)、大體損傷指數(shù)及組織學分級的評分，且發(fā)現(xiàn)模型組大鼠結腸組織COX-2和TNF-α表達水平異常增高，經過CCR5拮抗短肽治療，COX-2和TNF-α的表達明顯下降。說明HY拮抗短肽可通過下調COX-2和TNF-α的表達，減輕其與炎癥細胞相互作用，緩解腸道黏膜的炎癥損傷，促進腸黏膜修復與潰瘍愈合。推測CCR5膜外第二環(huán)特異結合的拮抗短肽，可能通過模擬CCR5配體的結合表位，結合在由跨膜區(qū)一些關鍵氨基酸殘基組成的疏水口袋中，誘發(fā)CCR5的ECL2區(qū)域的構象發(fā)生改變，阻止CCR5特異性配體與CCR5的結合，進而影響下游信號通路的級聯(lián)反應，減少炎癥細胞趨化和炎癥因子的釋放，從而抑制炎癥反應[18]。但同時發(fā)現(xiàn)CCR5胞外第一環(huán)的模擬肽對實驗大鼠結腸炎無明顯緩解作用，因而推斷可能由于CCR5與配體結合而發(fā)揮生理功能的主要位點是N末端和ECL2[19]的緣故。

因此，CCR5在結腸炎的炎癥反應機制中起重要作用，其胞外第二環(huán)的活性拮抗短肽對TNBS誘導的結腸炎模型大鼠具有治療作用。對于CCR5胞外第一環(huán)拮抗劑對結腸炎的作用機制和效果有待進一步的探索和評價。因此，合成性CCR5胞外第二環(huán)拮抗肽可能成為研究IBD治療一種候選藥物，為IBD的臨床治療方面的研究提供一種新的方法。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of antagonistic peptides binding specifically with first and second extracellular loops of CCR5 on colitis rats induced by TNB

SHU Mei1, SONG Yang-da1, LIU Si-xue1, SONG Yi-hang1, SHEN Xi-ming2, HUANG Hua-rong3, ZHONG Ying-qiang1

(1DepartmentofGastroenterology，2DepartmentofPathology，3DepartmentofPediatrics,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:zhongyingqiang@126.com；hhrvivi@126.com)

AIM: To study the effects of antagonistic peptides binding specifically with the first and second extracellular loops (ECL1 and ECL2) of C-C chemokine receptor 5 (CCR5) on the colitis rats induced by trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) and the mechanisms. METHODS: The colitis model of SD rats was induced by TNBS (100 mg/kg). The effects of 2 antagonistic peptides at different doses (ECL1： 25， 35 and 45 mg/kg； ECL2： 15， 25 and 35 mg/kg) on the model rats including the changes of disease activity index (DAI), colon macroscopic damage index (CMDI) and histological grading were observed. The mRNA and protein expression levels of TNF-α and COX-2 in the colonic mucosa were detected by real-time PCR and Western blot, respectively. RESULTS: Compared with model group, the changes of DAI, CMDI and histopathological injury of the rats treated with ECL2 antagonistic peptide HY at an appropriate dose were significantly reduced (P<0.05), and the protein and mRNA expression levels of TNF-α and COX-2 were significantly decreased (P<0.05). However, the effects of ECL1 antagonistic peptide GH on all scores and the expression levels of TNF-α and COX-2 were not obvious. CONCLUSION: ECL2 antagonistic peptide HY relieves TNBS-induced colitis in SD rats via down-regulating the expressions of TNF-α and COX-2 in the colonic mucosa, while the effect of ECL1 antagonist peptide GH was not obvious.

C-C chemokine receptor 5; Antagonistic peptide; Inflammatory bowel disease

1000- 4718(2017)05- 0902- 06

2016- 12- 13

2017- 02- 13

國家自然科學基金資助項目(No. 81370499)；廣東省自然科學基金資助項目(No. 2014A030313020； No. 2016A03031343)

R363； R965.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.022

雜志網址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 鐘英強 Tel： 020-81332598； E-mail: zhongyingqiang@126.com； 黃花榮 Tel： 020-81332446； E-mail: hhrvivi@126.com

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