阿帕替尼通過阻斷VEGF通路增強胃癌放療療效*

李 彤， 翟二濤， 許麗霞， 黃霖琳， 彭 穗， 曾志榮

(中山大學附屬第一醫院消化內科， 廣東 廣州 510080)

阿帕替尼通過阻斷VEGF通路增強胃癌放療療效*

李 彤， 翟二濤， 許麗霞， 黃霖琳， 彭 穗， 曾志榮△

(中山大學附屬第一醫院消化內科， 廣東 廣州 510080)

目的： 探討血管內皮生長因子(VEGF)受體2酪氨酸激酶抑制劑阿帕替尼對胃癌細胞株SGC-7901放療療效的影響及其可能機制。方法: 試驗設對照組、阿帕替尼組、單純放療組與聯合組。CCK-8法檢測細胞活力，流式細胞術分析細胞凋亡比例與細胞周期，免疫熒光染色觀察細胞核內γ-H2AX的表達，Western blot法檢測細胞增殖和凋亡相關蛋白。結果: 與阿帕替尼組或單純放療組相比，阿帕替尼聯合X射線顯著降低SGC-7901細胞的生長活力(P<0.01)，增殖相關蛋白p-PLCγ1和p-ERK1/2的水平下降；細胞凋亡比例明顯升高(P<0.01)，凋亡相關蛋白PARP、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白水平上調，Bcl-2表達下降；SGC-7901細胞核內γ-H2AX焦點淬滅延遲，表明阿帕替尼干擾放射線誘導的DNA雙鏈斷裂的修復；SGC-7901 G2期細胞比例顯著增高(P<0.01)。結論: 阿帕替尼通過阻斷VEGF通路增加胃癌細胞對X射線照射的敏感性。

胃癌； 放療； 阿帕替尼； 血管內皮生長因子

胃癌是常見的惡性腫瘤之一[1]，我國每年約有40萬例新發胃癌，占全球的43%[2]。我國胃癌篩查沒有韓國、日本等東亞國家普遍，多數患者確診時屬胃癌中晚期。胃癌的主要治療方法包括外科手術、化療、放療。盡管化療和手術治療的方法在不斷進步，但晚期胃癌患者的預后依然較差[3]。對于初期或手術后的病人，放療是良好的局部區域控制治療手段。研究表明，腫瘤組織中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的高表達與放療抵抗顯著相關[4]，靶向阻斷VEGF信號通路有潛在放療增敏的可能性。阿帕替尼(apatinib)是VEGF受體(VEGF receptor，VEGFR)2的酪氨酸激酶抑制劑，可靶向殺傷腫瘤細胞[5]。目前尚缺乏對阿帕替尼與胃癌放療相關性的研究。本研究擬觀察X線照射聯合阿帕替尼干預對胃癌細胞的細胞周期、細胞活力及凋亡的影響，并初步探討其分子信號通路，明確阿帕替尼是否可以增加胃癌對放療的敏感性，為指導臨床治療提供新的理論依據。

材 料 和 方 法

1 細胞和主要試劑

人胃癌細胞株SGC-7901購自中科院上海細胞庫。

RPMI-1640培養基、胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco)；PBS和RIPA細胞裂解液(Thermo Fisher Scientific)；阿帕替尼(恒瑞)；CCK-8試劑盒(Dojindo)；抗磷脂酶C(phospholipase C，PLC)、p-PLCγ1、p-ERK1/2、ERK1/2、多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase，PARP]、caspase-3、caspase-9、Bcl-2、GAPDH抗體和相應 II 抗(Cell Signaling Technology)；5% Triton、DAPI、山羊血清和多聚甲醛；兔抗人磷酸化組蛋白H2AX(γ-H2AX)抗體(Bioworld)；羊抗兔IgG(Santa Cruz)。

2 主要方法

2.1 細胞培養及實驗分組 SGC7901細胞置于含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養基(含1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養。實驗設4個組別：對照(control)組不作處理；阿帕替尼組使用終濃度為5 mmol/L的阿帕替尼處理；單純放療組接受10 Gy X射線的電離輻射(ionizing radiation，IR);聯合(combination)組使用5 mmol/L阿帕替尼處理24 h后接受10 Gy的X射線照射。

2.2 細胞活力的檢測 對數生長期SGC7901細胞接種于96孔板，每孔含有1×104細胞懸液100 μL。使用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養基培養對照組和單純放療組細胞；在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中加入終濃度為5 mmol/L的阿帕替尼培養阿帕替尼組和聯合組細胞。培養板放在培養箱中培養過夜，單純放療組與聯合組接受10 Gy的X線照射。向每孔加入10 μL CCK-8溶液(此后所有操作步驟均為避光進行)，將培養板在培養箱內孵育3 h。用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(A450)值，實驗獨立重復3次。

2.3 流式細胞術分析 對數生長期SGC7901細胞均勻接種于6孔板，每孔含5×105細胞。對照組和單純放療組常規培養，阿帕替尼組和聯合組給予終濃度為5 mmol/L的阿帕替尼處理，24 h后單純放療組和聯合組給予10 Gy X射線照射。各組細胞繼續培養24 h。PBS輕柔沖洗各組SGC-7901細胞后，將各組樣品一部分以PBS重懸為3×109/L單細胞懸液，每組取1 mL立即進行細胞凋亡檢測；另一部分以70%冰乙醇重懸為3×109/L單細胞懸液，-20 ℃固定過夜，每組取1 mL進行細胞周期檢測。實驗獨立重復3次。

2.4 Western blot法檢測蛋白質 細胞處理同上。棄細胞培養液，用RIPA細胞裂解液∶PMSF(10∶1)的混合溶液提取細胞總蛋白，酶標儀測定蛋白濃度。配10%的SDS-PAGE膠，每組取總蛋白30 μg上樣，恒壓，濃縮膠 80 V、分離膠 100 V電泳100 min， 4 ℃、400 mA轉膜120 min。裁膜，5% BSA室溫封閉 1.5 h，加入I抗于4 ℃孵育過夜，1×TBST洗膜，加入相應 II 抗室溫孵育2 h，1×TBST洗膜，曝光顯影。實驗獨立重復3次。

2.5 免疫熒光技術 細胞處理同上。將單純放療組、聯合組細胞分別在照射后1 h、6 h、12 h和24 h收集細胞，-20 ℃保存備用。全部細胞收集好后加3% H2O2室溫孵育30 min，PBS振蕩洗滌，多聚甲醛固定20 min，PBS振蕩洗滌；0.5% Triton破膜，PBS振蕩洗滌；滴加正常山羊血清封閉液，室溫放置60 min；滴加適當稀釋的兔抗人單克隆抗體，空白對照不加 I 抗，用PBS代替，室溫放置2 h，PBS振蕩洗滌；避光加入DAPI稀釋的熒光 II 抗，37 ℃溫箱、濕盒孵育60 min。PBS振蕩洗滌，水溶性封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡調至油鏡下觀察。

3 統計學處理

用SPSS 22.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用重復測量定量資料的方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 阿帕替尼聯合X線照射對SGC-7901細胞活力的影響

與阿帕替尼組或單純放療組相比，聯合組顯著降低SGC-7901細胞活力，差異具有統計學意義(P<0.01)。Western blot法檢測進一步證實，與單純放療組或阿帕替尼組相比，聯合組增殖相關蛋白p-PLCγ1和p-ERK1/2表達顯著下降，見圖1。

Figure 1.Apatinib and X-ray synergistically inhibited SGC-7901 cell viability. A:Avalues detected by CCK-8 assay; B: the protein levels of p-PLCγ1 and p-ERK1/2 determined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsIR group;##P<0.01vsapatinib group.

圖1 阿帕替尼聯合X線照射協同抑制SGC-7901細胞活力

2 阿帕替尼聯合X線照射對SGC-7901細胞凋亡的影響

流式細胞術分析結果顯示，對照組細胞的凋亡比例為4.081%，阿帕替尼組的細胞凋亡比例為10.42%，單純放療組的細胞凋亡比例為16.19%，聯合組的細胞凋亡比例為27.49%。阿帕替尼組與單純放療組的細胞凋亡比例均高于對照組，而聯合組的細胞凋亡比例明顯高于阿帕替尼組與單純放療組，差異均有統計學意義(P<0.01)。聯合組凋亡相關蛋白PARP、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3表達水平上調，Bcl-2表達下降，見圖2。

3 阿帕替尼聯合X線照射對SGC-7901細胞中γ-H2AX表達的影響

我們前期研究發現，VEGF通路關鍵蛋白在SGC-7901胃癌細胞株中呈現高表達狀態。應用10 Gy電離輻射劑量照射單純放療組與聯合組SGC-7901細胞株，結果發現2組1 h時均可見γ-H2AX核內焦點出現。單純放療組隨后核內焦點逐漸減少，12 h時接近照射前水平。而聯合組核內焦點淬滅延遲，24 h未恢復照射前水平，見圖3，表明聯合組雙鏈斷裂(double-strand breaks，DSBs)修復過程被干擾。

4 阿帕替尼聯合X線照射對SGC-7901細胞細胞周期影響

流式細胞術分析結果顯示，對照組的G2期細胞比例為7.08%，阿帕替尼組的G2期細胞比例為12.13%，單純放療組的G2期細胞比例為23.49%，聯合組的G2期SGC-7901細胞比例升高，為40.16%。與阿帕替尼組或單純放療組對比，聯合組阻滯于G2期的細胞比例顯著增高，差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖4。

討 論

胃癌根除術成功的患者因局部復發、遠處轉移風險高，5年生存率依然很低，放療可明顯減少淋巴引流區域復發，提高術后3年生存率和5年生存率[6-7]。對無遠處轉移(M0)的IV期胃癌患者實施放療可以降低腫瘤分期、減小瘤體，從而降低手術難度、增加胃癌根除術的成功率。而伴有遠處轉移(M1)的IV期胃癌患者，放療可緩解或治療出血、狹窄、疼痛等癥狀[8]。對于初期或手術后的病人，放療是一種良好的局部區域控制治療。但一部分胃癌患者會發生放療抵抗，導致放療療效不佳。胃周圍重要器官對放射線的耐受性限制了射線劑量的提高，因此尋找可增強胃癌的放療敏感性的藥物或手段，對于胃癌的治療有重要意義。

X射線用于腫瘤治療的原理是其能夠誘導細胞產生DNA雙鏈斷裂[9]。DSBs修復缺陷的細胞對放射線敏感性增加，DSBs修復蛋白高表達的細胞對射線耐受[10-11]。熒光標記的磷酸化組蛋白H2AX(γ-H2AX)是識別細胞內DSBs的有效標記物，細胞內殘留γ-H2AX焦點數量代表了細胞對DSBs的修復能力，與細胞放射敏感性有密切關系[12]。研究顯示，抑制VEGF信號通路可能減緩腫瘤細胞DSBs修復過程而增敏放療[13]。在本研究中，與單純放療組相比，聯合組細胞核內γ-H2AX熒光淬滅時間延遲，提示DSBs修復過程被干擾。其機制可能是放療誘導DSBs形成，而阿帕替尼通過抑制VEGF信號通路來干擾DSBs修復，從而抑制腫瘤細胞增殖，實現增敏放療。

Figure 2.Combination of apatinib and X-ray induced SGC-7901 cell apoptosis. A: the apoptotic rate determined by flow cytometry; B: the protein levels of cell apoptosis biomarkers determined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsIR group;##P<0.01vsapatinib group.

圖2 阿帕替尼聯合X線照射通過線粒體途徑誘導SGC-7901細胞凋亡

放療會誘導VEGF、成纖維細胞生長因子2和血小板源性生長因子等促血管生長因子的表達[14]，促進腫瘤血管生成，為腫瘤提供營養，抑制腫瘤血管生成可顯著增敏放療[15]。VEGF是很多實體腫瘤都分泌的調節血管形成最重要的信號分子，腫瘤組織中VEGF的高表達與放療抵抗顯著相關[4]。VEGFR包括VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3[16]。VEGFR2與配體結合后，比其它受體更顯著地增強激酶的活性，導致血管形成增強，微血管密度增大，血管內皮細胞增殖增強，與不良臨床預后更相關[17]。阿帕替尼靶向抑制VEGFR2的酪氨酸激酶發揮殺傷腫瘤的作用[5]，可顯著延長一線或二線化療失敗的晚期胃癌患者的中位生存期與無進展生存期[18]。

目前認為細胞凋亡途徑包括死亡受體通路介導的細胞凋亡和線粒體途徑介導的細胞凋亡[19]。有研究顯示，VEGF通路的激活可以抑制細胞凋亡，并通過PLC依賴的信號通路促進胃癌細胞增殖[20-21]，而放療過程中腫瘤細胞恢復增殖、凋亡信號傳導途徑中斷，是腫瘤對放射不敏感又一重要機制[22]。阿帕替尼可通過阻滯VEGFR2-PLCγ1-ERK1/2信號通路抑制胃癌細胞增殖，并減少VEGF的分泌[21]。在整個細胞增殖周期中，G2/M期對放射損傷最為敏感。細胞周期阻滯于G2期的腫瘤細胞對放療敏感性普遍高于阻滯在細胞周期其它階段的腫瘤細胞[23]。有報道阿帕替尼可引起細胞周期抑制蛋白p21和p27的上調及cyclin B1和Cdc1的下調，阻滯細胞周期于G2/M期[24]。

Figure 3.Detection of γ-H2AX expression by immunofluorescence cytochemistry. The combination group showed a delay of fluorescence quenching.

圖3 免疫熒光觀察阿帕替尼聯合X射線組γ-H2AX核內焦點淬滅延遲

Figure 4.Apatinib combined with X-ray blocked cell cycle in the G2/M phase. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsIR group;##P<0.01vsapatinib group.

圖4 阿帕替尼聯合X線照射使細胞周期阻滯于G2/M期

本研究發現，相對于阿帕替尼組或單純放療組，阿帕替尼聯合X射線可顯著提高SGC-7901細胞的凋亡比例，上調凋亡通路的標志物PARP、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白水平，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達，提示通過線粒體途徑誘導細胞凋亡。此外，兩者聯合可協同增加對SGC-7901胃癌細胞的生長抑制作用，顯著下調增殖相關蛋白p-PLC和p-ERK1/2的蛋白水平。阿帕替尼聯合X線照射可使G2期細胞比例較明顯增加，細胞周期阻滯于G2期，抑制腫瘤增殖，提高腫瘤細胞的放射敏感性。

基于本研究的初步探索，認為阿帕替尼可通過與VEGFR2結合，靶向阻斷VEGF通路，從而抑制DSBs修復，降低放療誘導的腫瘤血管形成效應，增加阻滯在G2期的胃癌細胞數目，抑制腫瘤增殖，誘導腫瘤凋亡，從而影響腫瘤組織對射線的敏感性，增強胃癌放療的效應，可為臨床胃癌實施放療時用阿帕替尼增敏放療提供理論依據。

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2):87-108.

[2] Ferlay J, Shin HR, Bray F, et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008[J]. Int J Cancer, 2010, 127(12):2893-2917.

[3] Ueda T, Volinia S, Okumura H, et al. Relation between microRNA expression and progression and prognosis of gastric cancer: a microRNA expression analysis[J]. Lancet Oncol, 2010, 11(2):136-146.

[4] 劉陽云， 劉庚勛， 李正賢， 等. VEGF表達預測鼻咽癌放療效應的價值[J]. 中國腫瘤，2014, 23(4):329-332.

[5] Scott AJ, Messersmith WA, Jimeno A. Apatinib: a promising oral antiangiogenic agent in the treatment of multiple solid tumors[J]. Drugs Today (Barc), 2015, 51(4):223-229.

[6] Yu JI, Lim do H, Ahn YC, et al. Effects of adjuvant radiotherapy on completely resected gastric cancer: a radiation oncologist’s view of the ARTIST randomized phase III trial[J]. Radiother Oncol, 2015, 117(1):171-177.

[7] Valentini V, Cellini F, Minsky BD, et al. Survival after radiotherapy in gastric cancer: systematic review and meta-analysis[J]. Radiother Oncol, 2009, 92(2):176-183.

[8] Izuishi K, Mori H. Recent strategies for treating stage IV gastric cancer: roles of palliative gastrectomy, chemotherapy, and radiotherapy[J]. J Gastrointestin Liver Dis, 2016, 25(1):87-94.

[9] Kuefner MA, Brand M, Engert C, et al. Radiation induced DNA double-strand breaks in radiology[J]. Rofo, 2015, 187(10):872-878.

[10]Kühne M, Riballo E, Rief N, et al. A double-strand break repair defect in ATM-deficient cells contributes to radiosensitivity[J]. Cancer Res， 2004, 64(2):500-508.

[11]Allal AS, Kahne T, Reverdin AK, et al. Radioresistance-related proteins in rectal cancer[J]. Proteomics, 2004, 4(8):2261-2269.

[12]Joist HE, Ahya SN, Giles K, et al. Differential effects of very high doses of doxercalciferol and paricalcitol on serum phosphorus in hemodialysis patients[J]. Clin Nephrol, 2006, 65(5):335-341.

[13]Shi L, Zhang S, Wu H, et al. MiR-200c increases the radiosensitivity of non-small-cell lung cancer cell line A549 by targeting VEGF-VEGFR2 pathway[J]. PLoS One, 2013, 8(10):e78344.

[14]Kleibeuker EA, Fokas E, Allen PD, et al. Low dose angiostatic treatment counteracts radiotherapy-induced tumor perfusion and enhances the anti-tumor effect[J]. Oncotarget, 2016, 7(47):76613-76627.

[15]Grifn RJ, Williams BW, Wild R, et al. Simultaneous inhibition of the receptor kinase activity of vascular endothelial, fibroblast, and platelet derived growth factors suppresses tumor growth and enhances tumor radiation response[J]. Cancer Res, 2002， 62(6):1702-1706.

[16]Glade-Bender J, Kandel JJ, Yamashiro DJ. VEGF blocking therapy in the treatment of cancer[J]. Expert Opin Biol Ther, 2003, 3(2):263-276.

[17]Roviello G, Ravelli A, Polom K, et al. Apatinib: A novel receptor tyrosine kinase inhibitor for the treatment of gastric cancer[J]. Cancer Lett,2016, 372(2):187-191.

[18]Li J, Qin S, Xu J, et al. Randomized, double-blind, placebo-controlled phase III trial of apatinib in patients with chemotherapy-refractory advanced or metastatic adenocarcinoma of the stomach or gastroesophageal junction[J]. J Clin Oncol, 2016, 34(13):1448-1454.

[19] 邵 棋, 曹 斐, 李 梅, 等. Integrin β1對胃癌細胞 SGC7901 多藥耐藥性的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(12): 2233-2238.

[20]Peng H, Zhang Q, Li J, et al. Apatinib inhibits VEGF signaling and promotes apoptosis in intrahepatic cholangiocarcinoma[J]. Oncotarget, 2016, 7(13):17220-17229.

[21]Lin Y, Zhai E, Liao B, et al. Autocrine VEGF signaling promotes cell proliferation through a PLC-dependent pathway and modulates Apatinib treatment efficacy in gastric cancer[J]. Oncotarget, 2017, 8(7): 11990-12002.

[22]Kim JJ, Tannock IF. Repopulation of cancer cells during therapy: an important cause of treatment failure[J]. Nat Rev Cancer, 2005, 5(7):516-525.

[23]Pawlik TM, Keyomarsi K. Role of cell cycle in mediating sensitivity to radiotherapy[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2004, 59(4):928-942.

[24]Rahimi N. Vascular endothelial growth factor receptors: molecular mechanisms of activation and therapeutic potentials[J]. Exp Eye Res, 2006, 83(5):1005-1016.

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Apatinib increases radiosensitivity of gastric cancer by inhibiting VEGF pathway

LI Tong, ZHAI Er-tao, XU Li-xia, HUANG Lin-lin, PENG Sui, ZENG Zhi-rong

(DepartmentofGastroenterology,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:zengzhirong@vip.163.com)

AIM: To investigate radiosensitization effect of apatinib, a vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor2 tyrosine kinase inhibitor, on human gastric carcinoma cell line SGC-7901 and its mechanism. METHODS: SGC-7901 cells were divided into control group, apatinib group, radiotherapy group and combination group. The cell viability was measured by CCK-8 assay. The changes of cell apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry. The protein levels of cell apoptosis biomarkers, such as PARP, cleaved caspase-9, cleaved caspase-3 and Bcl-2, and cell proliferation biomarkers, p-PLCγ1 and p-ERK1/2, were detected by Western blot. γ-H2AX expression was detected by immunofluorescence.RESULTS: Compared with apatinib group and radiation group, the cell viability was inhibited after treatment with both apatinib and X-ray (P<0.01). The protein levels of cell proliferation markers p-PLCγ1 and p-ERK1/2 were down-regulated. The cell apoptosis was enhanced (P<0.01). The protein levels of cell apoptosis makers such as PARP, cleaved caspase-9 and cleaved caspase-3 were up-regulated, while Bcl-2 was down-regulated. The disappearance of γ-H2AX foci in the nucleus was delayed, indicating that apatinib impaired the repair of radiation-induced DNA double-strand breaks. The proportion of G2phase was significantly increased (P<0.01). The combination treatment had more significant effect on SGC-7901 cells than treating with apatinib or radiotherapy alone. CONCLUSION: Apatinib increases the radiosensitivity of gastric cancer cells via blocking VEGF pathway.

Gastric carcinoma; Radiotherapy; Apatinib; Vascular endothelial growth factor

1000- 4718(2017)05- 0776- 06

2017- 01- 03

2017- 04- 06

國家自然科學基金資助項目(No. 81502079)； 廣州市科技計劃項目(No. 201607010074)

R730.23； R735.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.05.002

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