口服特比萘芬聯合5-氨基酮戊酸光動力治療淡紫擬青霉皮膚感染一例

王 鑫 張 韡 沈永年 呂桂霞 梅 嬛 蔣 娟

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·論著·

口服特比萘芬聯合5-氨基酮戊酸光動力治療淡紫擬青霉皮膚感染一例

王 鑫1*張 韡2*沈永年2呂桂霞2梅 嬛2蔣 娟2

患者,女，46歲。因右上臂紅斑伴瘙癢1年就診。根據其臨床癥狀和體征,受累組織器官中真菌的分離培養,組織病理學特征以及分子生物學鑒定技術，該病例診斷為淡紫擬青霉皮膚感染。體外藥敏試驗顯示對特比萘芬敏感，采用5-氨基酮戊酸光動力聯合口服特比萘芬治療取得較為滿意的治療效果。

淡紫擬青霉； 皮膚感染； 特比萘芬； 5-氨基酮戊酸光動力

淡紫擬青霉是一種腐生、無性絲狀真菌，廣泛分布于世界各地，是實驗室及醫療器械常見的污染菌之一。對于人類是一種機會致病真菌，可以通過外科手術，外傷接種，以及污染醫用材料引起免疫力低下者感染。近年來，免疫正常人群中感染病例報道也逐漸增多。目前報道的淡紫擬青霉引起的感染包括角膜炎、皮膚及皮下感染、甲真菌病、真菌血癥、肺炎、腹膜炎、骨髓炎、滑囊炎以及心內膜炎等。淡紫擬青霉對常用抗真菌藥物反應不佳，目前尚未有最佳治療藥物，臨床治療方案選用呈多樣性。本文報道了1例淡紫擬青霉引起的皮膚感染。

1 病例資料

患者，女，46歲。因右上臂紅斑伴有瘙癢1年于2015年11月17日就診于中國醫學科學院皮膚病研究所。患者自2014年2月無明顯誘因右側上臂出現數個黃豆大紅色丘疹，無明顯自覺癥狀。多次于當地醫院就診，診斷為“濕疹”，予地奈德乳膏，夫西地酸乳膏，中藥等藥物外用，效果均不佳，皮損從未消退，后逐漸擴大至不規則手掌大并出現瘙癢?；颊咂剿伢w健，否認其他系統疾病，否認發病前有外傷史。

皮膚科檢查：右側上臂伸側可見形狀不規則紅斑，境界較為清楚，大13 cm×13 cm,浸潤感較為明顯，呈肉芽腫樣增生，表面有少量脫屑，周圍可見粟粒至綠豆大衛星狀紅色丘疹。

實驗室檢查：(未檢查淋巴細胞亞群)血常規、甲狀腺功能、肝腎功能、梅毒及HIV抗體檢測均未見異常。

2 組織病理檢查

皮損處組織病理檢查示：角化過度，棘層輕度增生，真皮中上部可見彌漫的混合性炎性細胞浸潤，包括淋巴細胞、組織細胞、漿細胞、多核巨細胞和少量中性粒細胞浸潤，部分區域可見壞死灶。PAS染色：可見菌絲及孢子樣結構?？顾崛旧宏幮?。銀染色：陰性。見圖1～4。

3 真菌學檢查

真菌鏡檢及培養 刮取右上臂皮損處皮屑做10% KOH直接鏡檢，鏡下見較多無色、透明孢子及少量無色細長菌絲。取痂皮分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)、沙氏葡萄糖蛋白瓊脂培養基(SDA)、燕麥培養基(OA)，置于26℃培養，每日觀察2次，長出菌落后逐日觀察菌落形態及顏色變化(圖5)。2周后全部長出菌落，該菌在SDA上生長迅速,菌落初呈白色、羊毛狀；次代菌落逐漸變為淡灰紫色，菌落顏色呈同心圓分布。日久轉為暗灰紫紅色，背面為暗紫紅色。PDA培養基菌落形態同SDA。OA培養基上菌落舒展，初為白色羊毛狀菌落，很快轉變為暗灰色粉末狀菌落，鋪滿平皿。自上述SDA培養基中挑取該菌生長物在光學顯微鏡下進行觀察(圖6)，100倍和400倍鏡下見無色透明分支菌絲，分生孢子梗直立，長40～600 μm，寬3～4 μm，其頂端帚狀枝大多單輪生，偶見雙輪生，瓶?；颗虼?，頂部有逐漸錐形變細的瓶頸。分生孢子大部分為橢圓形或近球形，約2.5～3 μm×2～2.3 μm，分生孢子鏈呈柱狀或分散柱狀。依據其淡灰紫色菌落顏色和特征性瓶梗形態學特征鑒定為淡紫擬青霉。

4 分子生物學鑒定

對待測菌株的rRNA 的逆轉錄間隔區(ITS)和D1/D2區進行序列測定。增菌培養后分別提取標準株(中國微生物研究所淡紫擬青霉3.539)和臨床分離株的真菌基因組DNA后進行PCR擴增，選用真菌通用引物ITS1、ITS4、NL1、NL4(表1)擴增rDNA - ITS 區和D1/D2區基因。PCR反應總體積50 μL:其中引物2 μL,模板DNA (100～300 ng/μL)2 μL,dNTPs、Taq DNA 聚合酶等混合物25 μL,去離子水加至50 μL。反應條件:預變性95℃ 5 min;變性94℃ 30 s;退火55℃ 45 s;延伸72℃ 60 s, 共35個循環, 總延伸72℃ 7 min。取擴增產物進行凝膠電泳(圖7)。將擴增產物送上海生工有限公司純化后進行測序。將測得的序列結果用BLAST方式在美國NCBI的GENBANK數據庫中進行比對。待測株rDNA - ITS區和D1/D2區擴增片段大小分別為596 bp和608 bp，與標準菌株ATCC10114的相似性高達99%，鑒定為淡紫擬青霉。

表1 擴增通用引物序列及長度

圖1 角化過度，棘層輕度增生，真皮中上部可見彌漫混合性炎性細胞浸潤(HE，×100) 圖2 大量炎細胞浸潤(HE，×400)

圖3 組織中可見細長分枝菌絲(PAS，×400) 圖4 組織中可見酵母樣孢子(PAS，×400)

圖5 三種培養基中菌落形態(26℃，14 d) 圖6 鏡下見淡紫擬青霉帚狀枝(×400) 圖7 標準株和待測株D1/D2區(1a、1b)和rDNA-ITS區(2a、2b)的PCR產物

4 體外藥敏試驗

我們參照美國國家臨床實驗室標準委員會(NCCLS)頒布的產孢絲狀真菌液基微量稀釋法(M38-A)對該菌株進行了體外藥敏試驗。測得分離株MIC分別為特比萘芬0.25 μg/mL、伊曲康唑>8 μg/mL、氟康唑>64 μg/mL、酮康唑>8 μg/mL、奈替芬4 μg/mL、聯苯芐唑>8 μg/mL、益康唑>8 μg/mL、制霉菌素>8 μg/mL。該淡紫擬青霉對特比萘芬敏感。

5 治療與隨訪

予特比萘芬片(蘭美抒，北京諾華制藥)250 mg每日1次口服，予硝酸益康唑乳膏，聯苯芐唑洗劑，特比萘芬酊外用。患者按醫囑系統應用特比萘芬片5周后由于個人原因未能復診，自覺皮損顏色較前有所改善，于當地皮防所改用特比萘芬片(美莎抒，湖北恒安藥業)125 mg每日兩次口服，1周后在當地醫生指導下減量為125 mg每日1次，連續應用3周后患者自覺癥狀無明顯改善再次于我院就診。繼續予蘭美抒250 mg每日1次口服，鑒于患者未規律治療，且癥狀緩解不明顯，根據文獻查閱結果，選取1處皮損(2 cm×2 cm)進行5-氨基酮戊酸光動力(ALA)試驗性治療。將局部皮膚清洗消毒,避光環境下用注射用水將氨基酮戊酸散配制成20%溶液,將無菌脫脂棉放置在皮損處,將藥液滴于無菌脫脂棉上,并用塑料薄膜封包4 h。其后取出脫脂棉,暴露患處，進行光動力治療(光動力能量99 mV/cm2,每次時長20 min，每周1次)，3周后可見試驗處皮損與未接受光動力治療處皮損對照明顯消退，浸潤感減輕，顏色變暗出現色素沉著，考慮治療有效。故在此基礎上將全部皮損按上述方式進行ALA光動力治療，每周1次，共3周，同時繼續予蘭美抒250 mg 每日1次口服，定期檢測患者肝腎功能，均未見異常。1周后隨訪觀察患者皮損，紅斑面積縮小，部分皮損變平消退，可見表面結褐色痂皮，伴有色素沉著，患者自訴瘙癢癥狀消失。2周后隨訪，紅斑未進一步消退，建議患者繼續ALA光動力治療，后患者失去隨訪。治療效果見圖8～15。

圖8 首次就診皮損 圖9 特比萘芬服用2 w后皮損 圖10 局部治療部位(圓圈內) 圖11 第一次局部ALA-PDT后1 w皮損

圖12 第三次局部ALA-PDT后1 w皮損 圖13 第一次整體ALA-PDT后1 w皮損 圖14 第二次整體ALA-PDT后1 w皮損 圖15 第三次整體ALA-PDT后13 d皮損

6 討論

淡紫擬青霉對于人類是一種機會致病真菌，近年來，免疫正常人群中感染病例的報道也逐漸增多。無論在免疫力低下還是免疫正常者，皮膚屏障功能受損以及醫源性植入都是淡紫擬青霉入侵的門戶。其感染危險因素主要有器官移植、免疫抑制劑的使用、糖皮質激素治療、糖尿病、艾滋病和惡性腫瘤等。檢索萬方和PubMed數據庫，回顧1977-2013年間發表的國內外中英文文獻報道共49例病例，淡紫擬青霉發生在免疫健全者的病例中，部分有明確外傷史[1-4]，部分因務農、木工等[5-7]工作原因有可疑外傷史，還有少數無明顯誘因[8,9]。本例患者為家庭主婦，平素體健，無系統疾患及免疫缺陷，否認外傷史。分析現有文獻中淡紫擬青霉皮膚感染好發于四肢、面部等暴露部位，其中大多數分布于下肢57.1%(28/49), 約22.4%(11/49)分布于上肢，約8.2%(4/49)分布于面部、腹部等其他部位，12.2%(6/49)多處受累。通常起病隱匿且皮損表現呈多形性，包括單發的或彌漫性皮損，可表現為紅斑、丘疹、水皰、膿皰、壞死性結節或蜂窩織炎樣皮損，其中部分患者自覺疼痛，部分無明顯自覺癥狀。本例患者表現為右側上臂伸側境界清楚不規則紅斑，表面呈肉芽腫樣增生，自覺瘙癢明顯，分析可能與患者反復搔抓及多種外用藥物刺激有關。

淡紫擬青霉感染的診斷主要基于臨床癥狀體征，受累組織器官中真菌的分離培養以及組織病理學特征，必要時采用分子生物學技術。淡紫擬青霉對傳統抗真菌藥物大多不敏感，而早期治療對于控制淡紫擬青霉感染的進展和播散至關重要。因此，一旦確診，應盡早進行藥物敏感試驗以指導臨床治療。

淡紫擬青霉的體外藥敏實驗數據并不充足[10]?？傮w，兩性霉素B、氟胞嘧啶、氟康唑體外抗菌活性較低[9,11,12]；傳統的唑類抗真菌藥物如酮康唑、咪康唑、克霉唑和伊曲康唑等的最小抑制濃度范圍(MICs)不同文獻報道差異性大[10]；新型的三唑類藥物如伏立康唑、泊沙康唑、愛沙康唑、雷夫康唑等則有較高的體外活性[13]；特比萘芬的MICs有文獻中報道為0.25～0.5 mg/L[14]，還有文獻為1～8 mg/L；棘球白素類如卡泊芬凈、米卡芬凈相關數據有限且差異性大。對于不同抗真菌藥物的聯合應用，兩性霉素B與伏立康唑、雷夫康唑、阿巴康唑、特比萘芬聯用時，MICs明顯降低。特比萘芬分別與伏立康唑、阿巴康唑、伊曲康唑、雷夫康唑聯用時部分菌株中也表現為協同作用[1]。Ortoned等[15]學者進行的特比萘芬、兩性霉素B、米卡芬凈分別新型三唑類藥物聯合應用的體外實驗也基本支持上述結果。

臨床應用方面，傳統抗真菌藥氟康唑、氟胞嘧啶、兩性霉素B、克霉唑、咪康唑等臨床療效欠佳。伊曲康唑也較常應用于治療淡紫擬青霉感染，單藥治療成功率40%(10/25)。伏立康唑臨床治療效果較好，病例回顧中除因幻視或與免疫抑制劑他克莫司相互作用停用外[16-18]，其他病例均得到改善或者治愈。與國外文獻報道不同，目前國內兩例報道中[4,19]，體外實驗中菌株均對特比萘芬敏感，而對氟康唑、伊曲康唑、兩性霉素B敏感性較差，這與本例菌株體外藥敏試驗結果相同。由此推測，不同地域菌株體外藥物敏感性不同，應根據藥物敏感試驗結果選擇相應抗真菌藥物，當無法進行藥敏試驗時可首選伏立康唑。

本例患者是目前首個采用口服特比萘芬聯合ALA光動力治療皮膚淡紫擬青霉感染的病例。ALA光動力作用原理是光敏劑ALA聚集于異常細胞上，通過適當波長光照射，在氧的參與下，產生單線態氧等毒性活性產物，對細胞產生毒性作用，誘發病變組織發生壞死或損傷。ALA的主要優勢在于不良反應小、滲透性好，增加了作用的深度[20]。此前國內報道，Hu等[21]及其同事將ALA光動力與口服特比萘芬聯合應用于皮膚暗色絲孢霉病的治療中，共進行18次ALA光動力治療后皮損消退。結合分析本例患者，聯合治療后皮損明顯消退，但ALA光動力停止后兩周復發，考慮與療程不足有關，建議光動力治療持續至皮損完全消退，皮損處真菌鏡檢及病理活檢證明淡紫擬青霉陰性后，特比萘芬治療可繼續持續一段時間。

此外，不同抗真菌藥物的聯合使用[8,17,22,23]，外科手術與系統抗真菌藥物的聯合[9,12,25,26]，根據患者的不同情況也可進行應用。

7 結論

淡紫擬青霉為機會致病真菌，中等毒力，可以感染免疫缺陷或免疫正常人群，而且其對大部分傳統抗真菌藥物不敏感，因此，盡早進行真菌學與病理學檢查明確診斷。體外藥敏試驗對該病的治療具有重要的指導意義，必要時可以選擇ALA光動力聯合系統抗真菌藥物進行治療，治療必須足量、足療程。

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(收稿：2016-12-15 修回：2017-01-22)

Terbinafine combined with 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy in the treatment of cutaneous Paecilomyces lilacinus infection: a case report

WANGXin1,ZHANGWei2,SHENYongnian2,LYUGuixia2,MEIHuan2,JIANGJuan2.

1.DepartmentofDermatology,QingdaoWomenandChildren'sHospital,QingdaoUniversity，Qingdao266011,China; 2.InstituteofDermatology,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Nanjing210042,China

JIANGJuan,E-mail:drjjiang@vip.163.com

A 46 year-old woman presented with a pruritic erythema on the right upper arm for more than a year. The diagnosis of Paecilomyces lilacinus infection was made according to clinical manifestations, culture of the fungus, histological features of the lesions and molecular technique. The patient was sensitive to terbinafine and then treated with terbinafine combined with 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy (ALA-PDT) and the efficacy was good.

paecilomyces lilacinus; cutaneous infection; terbinafine; ALA-PDT

1青島大學附屬青島市婦女兒童醫院皮膚科,青島,266011 2中國醫學科學院北京協和醫學院皮膚病醫院,南京,210042

蔣娟，E-mail: drjjiang@vip.163.com

*共同第一作者