超聲波處理對纖維素酶法水解竹粉的影響

杜曉瑩， 傅佳佳,2， 王鴻博， 高衛東, 蔣春燕

(1. 江南大學 江蘇省功能紡織品工程技術研究中心， 江蘇 無錫 214122； 2. 蘇州大學 絲綢工程省級重點實驗室，江蘇 蘇州 215123； 3. 圣華盾防護科技股份有限公司， 江蘇 江陰 214413)

超聲波處理對纖維素酶法水解竹粉的影響

杜曉瑩1， 傅佳佳1,2， 王鴻博1， 高衛東1, 蔣春燕3

(1. 江南大學 江蘇省功能紡織品工程技術研究中心， 江蘇 無錫 214122； 2. 蘇州大學 絲綢工程省級重點實驗室，江蘇 蘇州 215123； 3. 圣華盾防護科技股份有限公司， 江蘇 江陰 214413)

針對采用生物酶法對竹材脫膠時竹材復雜致密的結構阻礙酶的作用的問題，在酶解前采用超聲波對竹材進行預處理。通過單因素試驗確定合適的超聲波預處理條件為：頻率20 kHz，功率960 W，時間15 min，浴比1∶30，室溫。相同酶解條件下使用纖維素酶分別水解超聲波處理竹粉和原竹粉，反應12 h時前者較后者生成的還原糖量提高了34.48%；通過掃描電子顯微鏡、紅外光譜和X射線衍射儀觀察超聲波預處理前后竹材表面、化學結構及結晶度變化。結果表明：經超聲波處理竹材表面結構被破壞，空隙和孔洞數量增加，有效接觸面積增加，結晶度降低了11.68%，但化學結構沒有明顯變化；超聲波是一種有效而溫和的預處理方式，不會改變竹材性質。

超聲波； 纖維素酶； 竹粉； 還原糖； 結晶度

近年來，竹纖維因具有天然抗菌、防紫外線、環保等優良特性而備受人們青睞[1]。按照不同的加工方法，目前市場上常見的竹纖維[2]主要可分為3類：竹原纖維、竹漿纖維和竹炭纖維。竹原纖維的制備方法有物理法、化學法、生物酶法。羅海等[3]采用蒸汽爆破有效地分離了竹纖維；王春紅等[4]采用化學方法處理爆破后的竹原纖維，制得了高拉伸強度(與玻璃纖維接近)和柔軟度的竹原纖維；鄧首哲等[5]采用生物酶法對竹纖維進行脫膠，得出了半纖維素酶對竹纖維脫膠有一定效果的結論。

竹材主要成分為纖維素、半纖維素、木質素，這3種物質相互交聯、纏結，構成了竹材本身復雜而致密的結構。研究表明，纖維素是竹中對酶而言最可及的物質[6]，且在天然的漚竹體系中測得纖維素酶活存在，因此，選用纖維素酶水解竹材，以期打開竹材的致密結構，為后續脫膠酶的滲透提供有效通道。竹材復雜的結構及結晶區的存在影響了水解效率。為提高水解效率，在纖維素酶水解竹粉前需采用預處理方式處理竹材，以改變竹材表面可及度及結晶度。竹粉常見的預處理方式有高溫高壓法、微波法和超聲波法。高溫高壓法需要較大的外界能量，采用微波法作用時產生的溫度會對纖維造成損傷，因此本文采用超聲波法作為預處理方式處理竹粉。

超聲波是一種高效、環保的新型能量形式，目前已有研究者將超聲波與生物酶聯合使用處理秸稈、蔗渣等生態廢棄物以制備新型燃料生態乙醇[7-8]。超聲波處理過程中會產生熱效應、機械效應和空化效應[9]。本文主要利用超聲波在液體介質中的空化效應預處理竹粉，以改變竹粉結構，提高酶解效率，從而為生物酶高效水解木質纖維素纖維提供一種有效途徑。

1 試驗部分

1.1 原料與試劑

原料：過60目篩的1年生毛竹粉末，用甲苯和乙醇按體積比2∶1混合對竹粉進行抽提[10]，抽提后竹粉作為試驗用原竹粉。

主要試劑：中性纖維素酶8000L，購于上海諾維信(Novozymes)公司；羧甲基纖維素(CMC)，3，5-二硝基水楊酸(DNS)，考馬斯亮藍G-250，牛血清白蛋白(BAS)，購于百靈威科技有限公司。

1.2 主要儀器

儀器：FS-1200超聲波處理器(上海生析超聲儀器有限公司)；UV-9600紫外/可見分光光度計(北京瑞利分析儀器有限公司)；SU1510掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；NICOLET IS 10紅外光譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；X射線衍射儀(德國布魯克AXS有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 纖維素酶比酶活的測定

采用DNS法[10]確定最適條件下纖維素酶酶活。酶活定義：每分鐘CMC產生1 μmol葡萄糖的酶量為1個單位(U)的酶活。采用Bradford法[11]測定纖維素酶的蛋白質含量，計算得到所用纖維素酶的比酶活。比酶活定義為每毫克蛋白的酶活力。

1.3.2 超聲波預處理

稱取0.2 g竹粉置于塑料離心管中，經不同的超聲波條件處理，以相同纖維素酶酶解條件下還原糖的產量為指標，確定適宜的超聲波處理條件。本文試驗采用的超聲波儀器頻率為20 kHz，采用單因素分析法確定其他超聲波處理參數：功率為240～1 200 W，10%的增率變化，時間為10、20、30、40、50 min，浴比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50。超聲波處理后的竹粉用去離子水清洗并在室溫條件下自然風干。

1.3.3 纖維素酶水解

稱取0.05 g經超聲波處理的竹粉于50 mL錐形瓶中，加入5 mL纖維素酶，用pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液定容至15 mL。對照樣中所加竹粉為未經超聲波處理的原竹粉。每組樣品需要同時進行2個平行試樣測試。將裝有以上反應體系的錐形瓶放入50 ℃的恒溫振蕩水浴鍋中，分別在反應0、2、4、6、8、10、12、24 h時用移液器取0.3 mL的反應液于0.5 mL離心管中，離心機離心后，置于-4 ℃冰箱待用。

1.3.4 還原糖產量測定

所有樣品取樣完畢后，分別從每個離心管中取0.2 mL上清液于試管中，與DNS試劑進行顯色反應，測定還原糖含量[10]。用紫外分光光度計測520 nm處吸光度值，根據之前繪制的葡萄糖標準曲線換算為還原糖量。

1.3.5 形貌觀察

分別對原竹粉及超聲波處理后竹粉表面噴金制樣，用掃描電鏡觀察竹粉表面結構的變化。

1.3.6 紅外光譜分析

分別將原竹粉與超聲波處理竹粉與溴化鉀粉末以1∶100的質量比混合均勻并研磨壓片，使用紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內掃描。

1.3.7 結晶度測試

采用X射線衍射儀掃描原竹粉和超聲波處理竹粉。測試條件為：40 kV管電壓、40 mA管電流、Ni濾波、Cu靶、Kα射線、掃描范圍在6°～40°之間，速度4(°)/min，采用Jade軟件[12]對圖譜進行分峰、擬合并計算超聲波處理前后竹粉的結晶度。

2 結果與討論

2.1 纖維素酶性質

本文試驗中所用纖維素酶為中性纖維素酶，最適反應條件為pH值7.0，50 ℃。在此條件下測得1 mL酶液的酶活為3.12 U，對應的蛋白含量為1.52 mg，經計算得此酶的比酶活為2.05 U/mg。

2.2 超聲波預處理條件優化

2.2.1 功 率

超聲波處理條件為：頻率20 kHz，時間30 min，浴比1∶20，室溫。超聲波功率對還原糖產量(反應12 h)的影響如圖1所示。可以看出，隨超聲波功率的增加，還原糖生成量的總體趨勢是先增后減。低功率超聲波處理(240、360、480 W)竹粉時，還原糖產量甚至低于原竹粉。這是因為超聲波處理會先破壞竹粉的無定形區，結晶區比例增加，酶液較難進入竹粉內部，纖維素酶水解產生的還原糖量也隨之減少。隨著超聲波功率的增加(600、720、840、960 W)，竹粉的結晶區也被超聲波產生的較大剪切力破壞，纖維素酶進入竹粉內部，還原糖產量增加，但超聲波功率繼續增加(1 080、1 200 W)，還原糖產量反而下降。這是因為超聲波空化效應產生的巨大的高溫高壓會直接破壞竹粉的多糖物質，即便纖維素酶進入竹粉內部，也無更多的多糖物質可分解為還原糖。結合圖1可以得出，最優超聲波處理功率為960 W。

圖1 超聲波處理功率對還原糖產量的影響Fig.1 Influence of ultrasonic power on reducing sugar yield

2.2.2 時 間

超聲波處理條件為：頻率20 kHz，功率960 W，浴比1∶20，室溫。超聲波處理浴比對還原糖產量(反應12 h)的影響如圖2所示。可以看出，還原糖產量隨超聲波處理時間的變化與隨超聲波處理功率變化趨勢基本一致，隨著超聲作用時間的增加，生成的還原糖量先增加再減少。這是因為超聲波處理功率和超聲波處理時間都和超聲波的空化強度有關。由圖2可知，超聲波處理15 min和20 min的還原糖產量相同，從節約能量、降低成本方面考慮，最優超聲波處理時間為15 min。

圖2 超聲波處理時間對還原糖產量的影響Fig.2 Influence of ultrasonic time on reducing sugar yield

2.2.3 浴 比

超聲波處理條件為：頻率20 kHz，功率960 W，時間15 min，室溫。超聲波處理浴比對還原糖產量(反應12h)的影響如圖3所示。超聲波的空化效應是在液體介質中發生的，且超聲波探頭放入所處理樣品中的深度是一定的。當竹粉的去離子水懸浮液中水的含量增加到一定程度時，超聲波探頭距離樣品容器底部的距離增加，超聲波所需傳播的距離增加，作用也就減弱。由圖3可知，最優超聲波處理浴比為1∶30。

圖3 超聲波處理浴比對還原糖產量的影響Fig.3 Influence of ultrasonic bath ratio on reducing sugar yield

2.3 超聲波預處理效果

超聲波預處理效果以纖維素酶水解竹粉生成的還原糖量為評價指標。超聲波預處理對纖維素酶水解竹粉產生還原糖量的影響如圖4所示。可以看出，在纖維素酶水解竹粉反應進行0～12 h的過程中，超聲波處理后竹粉生成的還原糖量均要高于原竹粉生成的還原糖量。經計算，水解反應12 h時超聲波處理竹粉生成的還原糖量較原竹粉提高了34.48%。2種竹粉的整體酶解趨勢大致相同：0～2 h時還原糖產量迅速增加，2～12 h時還原糖產量緩慢增加。由圖4可知，纖維素酶水解超聲波處理竹粉生成的還原糖量和反應速率較原竹粉均有相應的提高。這是因為竹粉復雜致密的結構經超聲波空化作用被破壞，竹粉擁有更多的酶附著位點，可以吸附更多的纖維素酶。

圖4 超聲波處理對還原糖產量的影響Fig.4 Influence of ultrasonic pretreatment on reducing sugar yield

2.4 表面形態結構

原竹粉和超聲波處理竹粉的掃描電鏡照片如圖5所示。由圖可見：原竹粉結構排列整齊且表面較平滑，表面雜亂部分是由機械粉碎造成的破壞；經超聲波處理后竹粉表面結構明顯發生改變，竹粉平滑的表面被破壞，表面出現很多孔洞，很多部位中腔結構暴露，這些變化為生物酶的吸附提供了較多的附著位點，有助于生物酶水解效率的提高。此現象的產生原因為：超聲波的空化效應使組織間氣泡崩潰的同時，產生瞬間的高溫、高壓以及強大沖擊力，直接作用在竹粉上破壞了竹粉表面形態結構。

圖5 超聲波處理前后竹粉的SEM照片Fig.5 SEM images of bamboo powder. (a) Original bamboo powder(×1 500)；(b) Original bamboo powder (×2 500)；(c) Ultrasonic-pretreated bamboo powder (×1 500)；(d) Ultrasonic-pretreated bamboo powder (×2 500)

2.5 化學結構

原竹粉和超聲波處理后竹粉在4 000～400 cm-1范圍的紅外光譜圖如圖6所示。3 365 cm-1處的寬吸收帶是O—H的伸縮振動，2 900 cm-1處的吸收峰是C—H的伸縮振動峰，1 645 cm-1處的吸收峰是O—H結晶水的，在1 610、1 595和897 cm-1處的特征峰與木質素相關，1 089和1 078 cm-1處的特征峰與半纖維素相關[13]，1 318 cm-1處為纖維素中C—H的變形振動峰[14]。對比超聲波處理前后竹粉的紅外光譜圖發現，譜圖并未發生明顯變化，這說明超聲波處理并未引起竹粉化學結構的變化，因此超聲波是一種溫和且有效的預處理方式。

圖6 超聲波處理前后竹粉的紅外光譜圖Fig.6 Fourier transform infrared spectra of bamboo powder before and after ultrasonic pretreatment

2.6 結晶度

原竹粉和超聲波處理后竹粉的X射線衍射圖譜如圖7所示。經Jade分峰、擬合計算得到原竹粉的結晶度為47.09%，超聲波處理后竹粉的結晶度為35.41%，降低了11.68%。結晶度的降低與超聲波的空化效應、熱效應、機械效應破壞竹粉的結晶區有關。結晶度的降低代表竹粉的無定形比例增大，這樣竹粉的可及性提高，酶液更容易進入竹粉內部，水解效率增加。

圖7 超聲波處理前后竹粉的X射線衍射圖Fig.7 X-ray diffraction patterns of bamboo powder before and after ultrasonic pretreatment

3 結 論

1)在室溫浴比為1∶30的條件下，采用頻率為20 kHz，功率為960 W的超聲波處理竹粉15 min，使用中性纖維素酶水解，經此條件預處理竹粉的產糖量較原竹粉最大提高了34.48%。

2)經超聲波預處理后竹粉表面結構被破壞，可直接接觸比表面積增加，使得酶液更易與竹粉接觸，生物酶水解效率提高。

3)超聲波預處理前后與木質素、半纖維素、纖維素相關的特征峰并未發生明顯變化，表明超聲波處理對竹粉的化學結構沒有顯著影響。

4)超聲波預處理竹粉結晶度較原竹粉降低了12.90%，使得酶液更易進入竹粉內部，生物酶水解效率增加。FZXB

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Influence of ultrasonic treatment on cellulase hydrolysis of bamboo powder

DU Xiaoying1， FU Jiajia1,2， WANG Hongbo1， GAO Weidong1， JIANG Chunyan3

(1.JiangsuEngineeringTechnologyResearchCenterforFunctionalTextiles,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China； 2.NationalEngineeringLaboratoryforModernSilk,SoochowUniversity,Suzhou,Jiangsu215123,China； 3.WotoProtection&Tech.Co.,Ltd.,Jiangyin,Jiangsu214413,China)

The complicated and compacted structure of bamboo hindered the effect of enzymatic hydrolysis when the enzymatic degumming of bamboo was carried out. Therefore, ultrasound was employed to pretreat bamboo powders prior to enzymatic treating with the purpose of improving the efficiency of cellulase hydrolysis on bamboo powder. Results from univariate analysis indicated the preferred ultrasonic pretreatment should be carried out at room temperature for 15 min with the bath ratio of 1∶30, the frequency of 20 kHz, and the power of 960 W. Under the same conditions, the reducing sugar yield from cellulase hydrolysis of ultrasonic-pretreated bamboo powder increased by 34.48% compared with bamboo powder without pretreatment after the reaction for 12 h. The changes in surface structure, chemical components and crystallinity of bamboo powder with and without ultrasonic pretreatment were evaluated by scanning electron microscopy, infrared spectroscopy and X-ray diffraction. The results demonstrated that the surface structure of bamboo powders is damaged，and the number of gap and pores is increased, thus the valid surface for enzyme binding increased. The crystallinity of ultrasonic treated bamboo was decreased by 11.68% but chemical structure showed no significant change. These results suggest that ultrasonic pretreatment is effective and mild without changing the properties of bamboo.

ultrasonic； cellulase； bamboo powder； reducing sugar； crystallinity

10.13475/j.fzxb.20160104905

2016-01-22

2016-06-15

國家自然科學基金資助項目(31470509，31201134)；江蘇省基礎研究計劃(自然科學基金)青年基金項目(BK2012112)；江蘇省產學研前瞻性研究項目(BY2013015-24)；現代絲綢國家工程實驗室技術創新基金資助項目(蘇州大學絲綢工程省級重點實驗室開放課題)(KJS1312)

杜曉瑩(1989—)，女，碩士生。研究方向為功能紡織材料。傅佳佳，通信作者，E-mail: kathyfjj@126.com。

TS 102.2

A