干擾素調節因子8在骨髓增生異常綜合征伴原始細胞增多亞型中的表達研究

徐旭棟　肖湘陽　陳龍　王劍超

[摘要] 目的 研究干擾素調節因子8（interferon regulatory factor 8，IRF-8）在骨髓增生異常綜合征伴原始細胞增多（Myelodysplastic Syndromes with Excess Blasts，MDS-EB）亞型中是否存在表達異常，并分析其與MDS-EB的相關性。方法 收集三組共30例實驗標本。其中20例為MDS-EB病例標本，分為MDS-EB1組和MDS-EB2組。10例為健康體檢的健康對照組。30例標本均采集自受試者外周靜脈血，采集后立即進行外周血總RNA提取，并經逆轉錄PCR后，以實時熒光定量PCR檢測各標本的IRF-8 mRNA表達水平。各組平均表達量以RQ值（x±s）表示。 結果 三組樣本實時熒光定量PCR的平均RQ值：MDS-EB1組（0.59±0.08），MDS-EB2組（0.26±0.10），健康對照組（1.20±0.26），三組表達水平存在顯著差異（P<0.01）。MDS-EB組的IRF-8表達水平均顯著低于健康對照組（P<0.01），MDS-EB2組內IRF-8表達水平低于MDS-EB1組（P<0.05）。 結論 IRF-8在MDS-EB中表達水平降低，表明IRF-8在MDS-EB中表達受抑，組間統計結果提示IRF-8的表達可能與疾病的惡性程度及進展相關。

[關鍵詞] 干擾素調節因子8；骨髓增生異常綜合征伴原始細胞增多；外周血RNA；逆轉錄PCR；實時熒光定量PCR

[中圖分類號] R551.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）09-0043-05

Study on expression of interferon regulatory factor 8 in myelodysplastic syndromes with excess blasts subtype

XU Xudong1 XIAO Xiangyang1 CHEN Long1 WANG Jianchao2

1.Zhejiang Chinese Medicine University Second Clinical Medical College， Hangzhou 310053， China； 2.The Second Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310005， China

[Abstract] Objective To investigate whether the expression of interferon regulatory factor 8（IRF-8） is abnormal in myelodysplastic syndromes with excess blasts （MDS-EB） subtype and to analyze its correlation with MDS-EB. Methods A total of 30 experimental specimens from three groups were collected. 20 cases were MDS-EB case specimens and divided into MDS-EB1 group and MDS-EB2 group. 10 cases of healthy physical examination were as healthy control group. All the samples were collected from the peripheral venous blood of the subjects. The total RNA was extracted from the peripheral blood immediately after the collection. The expression level of IRF-8 mRNA was detected by real-time fluorescence quantitative PCR after reverse transcription PCR. The average expression of each group was expressed as RQ（x±s）. Results The mean RQ values of real-time fluorescent quantitative PCR in the three groups were MDS-EB1（0.59±0.08）， MDS-EB2（0.26±0.10）， healthy control（1.20±0.26）， and there was significant difference among the three groups（P<0.01）. The expression level of IRF-8 in MDS-EB group was significantly lower than that in the healthy control group（P<0.01）， and the expression level of IRF-8 in MDS-EB2 group was lower than that in MDS-EB1 group（P<0.05）. Conclusion The expression of IRF-8 in MDS-EB decreases， indicating that IRF-8 expression is inhibited in MDS-EB. Intergroup statistical results suggest that IRF-8 expression may be related to the degree of malignancy and progression of disease.

[Key words] Interferon regulatory factor 8； Myelodysplastic syndromes with excess Blasts； Peripheral blood RNA； Reverse transcription PCR； Real-time quantitative PCR

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）是一組源于髓系造血干細胞的克隆性疾病。根據WHO 2016年出版的診斷指南，MDS目前主要有8種亞型[1]，其中病情程度較為嚴重的亞型是骨髓增生異常綜合征伴原始細胞增多（MDS-EB）。MDS-EB占所有MDS亞型中發病的34.2%[2]。MDS-EB的骨髓原始細胞數目可達到5%～19%，根據MDS國際預后積分系統（IPSS）的評價，MDS-EB一般可劃分為中危或高危，平均轉白率接近40%[3]，其發病及轉白過程中，可存在多種基因位點的突變和相關細胞因子的表達沉默，但其機制尚不明確。

干擾素調節因子（interferon regulatory factor，IRF）是一種具有抗病毒、抗腫瘤、調節機體免疫功能等多種功能的細胞因子[4]，IRF-8是其重要的家族成員之一，在腫瘤發病以及抗腫瘤相關免疫中具有重要作用[5，6]。在血液腫瘤方面，IRF-8表達缺失是慢性髓細胞性白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）發病的重要分子事件，大多數CML患者的IRF-8 mRNA表達嚴重缺乏[7]。而同樣作為血液腫瘤疾病的MDS-EB，目前還未有與IRF-8表達相關的研究報道。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2014年12月～2016年12月收集浙江中醫藥大學附屬第二醫院血液科住院的MDS-EB患者20例作為研究對象，并根據臨床資料分為MDS-EB1組和MDS-EB2組。MDS-EB1組樣本來自臨床確診的MDS-EB1患者，骨髓報告提示原始細胞數>5%且<10%。MDS-EB2組樣本來自臨床確診的MDS-EB2患者，骨髓報告提示原始細胞數>10%且<20%。另收集10例健康樣本作為健康對照組，標本來自我院健康體檢人群。所有入選者均簽署知情同意書。20例MDS-EB患者及10例健康對照組均依據受試者臨床特征、外周血象、骨髓細胞形態學等進行統一分組編號。臨床特點見表1、2。

1.2方法

采用實時熒光定量PCR法測定外周血單個核細胞IRF-8 mRNA的表達水平。

1.2.1總RNA抽提 使用肝素抗凝管采集新鮮外周血，自然沉淀后收集上清液，1000 rpm離心15 min，分裝上清，-80℃凍存。沉淀后的細胞部分以PBS洗滌，Ficoll分離外周血單個核細胞后，迅速進行總RNA抽提。

1.2.2 OD260/OD280 抽提總RNA后，取2 μL總RNA樣品，測定260 nm、280 nm的吸光值，計算OD260/OD280，測定其純度和濃度。

1.2.3 IRF-8的相對表達量 使用SYBR熒光染料試劑盒對樣本進行定量分析，每個樣本重復3次。引物由上海生工生物技術公司合成。IRF-8引物序列：上游引物5-TTGTTGCCAGGAAGATTAG-3，下游引物5-CAAAGGAGAAAGGAGGACA-3。計算機自動Ct分析法獲得各個反應孔的Ct值，計算不同樣本的平均Ct值，應用△△Ct法計算表達量。IRF-8用內參基因GAPDH進行校正，應用Step One Plus 2.2.3軟件進行數據處理，根據公式2-△△Ct（RQ）計算IRF-8的相對表達量。

1.3統計學方法

采用SPSS17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用方差分析，再采用LSD-t檢驗行兩兩比較，P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1 總RNA提取濃度檢測

對30個標本進行總RNA提取后進行濃度測定，各組平均濃度分別為MDS-EB1組（642±199）ng/μL，MDS-EB2組（495±110）ng/μL，健康對照組（514±88）ng/μL，具體數值見表3。各標本濃度符合進一步實驗要求。

2.2實時熒光定量PCR結果

通過對三組樣品進行實時熒光定量PCR檢測，用內參基因GAPDH對結果進行校正。檢測結果平均RQ值：MDS-EB1組（0.59±0.08），MDS-EB2組（0.26±0.10），健康對照組（1.20±0.26），具體數值及表達水平見表4和圖1。

采用SPSS17.0統計軟件對三組數據進行成對樣本檢驗，三組實驗樣本間表達量存在顯著差異（P<0.01）。MDS-EB1組及MDS-EB2組的平均IRF-8表達水平均顯著低于健康對照組（P<0.05），且MDS-EB2組的平均表達水平顯著低于MDS-EB1組（P<0.05）。

3討論

迄今為止，對于MDS發病及其演變機制尚無明確定論，但一般認為骨髓免疫異常、基因水平改變、遺傳學異常和細胞凋亡過度等是導致MDS骨髓造血干細胞克隆性病變的四大重要因素。近年來隨著分子生物學技術的發展，對于MDS的分子診斷研究已經逐漸成為熱點，在WHO最新出版的2016年MDS診斷指南中，提及了9種在MDS中80%～90%常見基因異常，包括SF3B1、TET2、SRSF2、ASXL1、DNMT3A、RUNX1、U2AF1、TP53和EZH2[1]。其中，SF3B1作為骨髓增生異常綜合征伴環形鐵粒幼紅細胞增多（myelodysplastic syndrome with ring sideroblast，MDS-RS）非常重要的一個分子突變位點，對于疾病的診治具有重要意義[8]。但另一方面，與其他血液腫瘤不同，目前臨床上反應MDS療效的生物標記物還非常有限[9]，尤其在MDS-EB這一亞型方面。

IRF-8是IFN-γ調控因子家族的成員，對于髓系細胞生成非常重要[10]，其作為IFN-γ/STAT1信號通路的關鍵分子，參與JAK/STAT的調控過程[11]，并介導Fas、Bax、FLIP、JAK1和STAT1的表達實現實體瘤細胞凋亡[12，13]。Watanabe T等[14]也在IRF-/-的小鼠實驗中發現，IRF-8在調節髓細胞生成、發展分化及生長過程中起著重要的決定性作用。另外也證實了IRF-8在急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）、CML中的腫瘤抑制功能，恢復IRF-8的表達可拮抗Bcr/Abl的致瘤性作用[15]。

本研究將IRF-8運用到MDS-EB中，通過檢測其mRNA的表達水平分析IRF-8的表達是否異常。實驗結果顯示相較于健康對照組，MDS-EB組的表達水平顯著降低，表明IRF-8在MDS-EB發病過程中表達受到明顯抑制，提示IRF-8可能是一種MDS-EB的抑制基因，對MDS-EB發病具有抑制作用。另外MDS-EB組間對比顯示MDS-EB2中IRF-8的表達水平比MDS-EB1更低，這可能與IRF-8調節骨髓細胞生成、促進髓細胞分化成熟的作用有關[16]。因此IRF-8的表達抑制可能會造成骨髓細胞的成熟障礙，從而導致原始細胞數量增加，而原始細胞數量的增加與MDS-EB的發病和轉白都具有密切關聯，提示IRF-8的表達水平對于MDS-EB的疾病進展具有重要提示作用。

本研究中發現IRF-8在MDS-EB中表達存在抑制，而這種抑制可能涉及多種分子機制，并且與腫瘤的發病發展相關。在一些實體瘤中，異常甲基化是腫瘤發病的重要原因之一，實驗研究表明，鼻咽癌和消化道腫瘤中，IRF-8啟動子的異常甲基化會導致IRF-8表達抑制[17]，在腎細胞癌（RCC）中IRF-8作為功能性腫瘤抑制因子也經常發生甲基化[18]，而婁曄等[19]發現MDS-EB存在高甲基化狀態，這可能與IRF-8的表達抑制相關。當然除甲基化外，組蛋白修飾等表觀遺傳機制也參與IRF-8的抑制表達。Banik等[20]研究發現IRF-8對組蛋白脫乙酰酶抑制劑的抗腫瘤活性具有重要作用，并且確認了IRF-8-MMP3新的腫瘤發病機制。Wonyong Lee等[21]研究表明甲基化試劑聯合組蛋白脫乙酰酶抑制劑才能恢復IRF-8 mRNA水平的表達，這說明多種IRF-8的抑制機制可能存在多種控制中心。而在對IRF8-/-的小鼠模型恢復IRF-8表達能力后，證實IRF-8對AML和CML具有腫瘤抑制功能。因此，IRF-8對于MDS-EB也可能具有重要的抑制作用。

目前，一些腫瘤藥物的開發研究主要用于抑制腫瘤細胞的增殖，從而達到緩解疾病的效果。如華蟾素就具有體內外抑制人胰腺癌細胞增殖作用[22]，而基于多信號通路報告基因對于這類藥物抑制腫瘤進展的分子機制研究具有重要作用。IRF-8作為多種細胞信號通路當中的關鍵分子，其表達和抑制對于腫瘤進展及藥物療效都具有重要的提示意義。因此進一步研究IRF-8的分子機制不僅能對MDS-EB的靶向治療奠定實驗基礎，還能對于華蟾素等腫瘤抑制藥物在抑制腫瘤過程中的分子作用機制提供研究價值。

另一方面，在MDS-EB的發病機制上，除遺傳學異常以外，骨髓免疫異常也被認為是MDS-EB發病的一個重要原因。而骨髓免疫異常也是免疫相關性全血細胞減少癥（immuno-related pancytopenia，IRP）的主要發病原因。這兩種疾病都具有骨髓造血異常、貧血等相似的臨床癥狀，因此在臨床鑒別上具有一定難度。IRP的發病機制一般認為與T淋巴細胞的調控異常有關，并伴有TH1、TH2、TH17陽性細胞比例異常[23，24]。而IRF-8在T淋巴細胞與B淋巴細胞的誘導分化上具有重要作用[25-28]，并且具有抑制Th17細胞分化的作用。所以，IRF-8不僅在MDS-EB中存在異常表達，也可能在IRP中也有異常表達，因此進一步研究IRF-8的作用與功能，對于這兩種疾病發病機制的研究和鑒別均具有重要價值。

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（收稿日期：2017-02-05）