炎癥性腸病的基因共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

葉樺　　柳惠未　　黃詩良　張學松　　黃莎　高志強　劉偉　宋毓飛

[摘要] 目的 用共表達網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)生物學分析炎癥性腸?。↖nflammatory Bowel Disease，IBD）主要包括潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohns disease，CD）的生物學功能，為疾病機制研究和藥物開發(fā)提供重要信息。 方法 本文以公共數(shù)據(jù)庫中的212個IBD RNA-Seq數(shù)據(jù)為對象，用權(quán)重基因共表達分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis，WGCNA）方法構(gòu)建其基因共表達網(wǎng)絡(luò)，數(shù)據(jù)庫注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）工具分析模塊數(shù)據(jù)，并利用藥物處理基因表達譜數(shù)據(jù)庫（Connectivity map，CMAP），對可能的治療藥物進行篩選。 結(jié)果 （1）共鑒定出12個具有生物學意義的共表達基因模塊，模塊的功能與免疫應(yīng)答、血管生成、轉(zhuǎn)錄、翻譯、能量代謝等生物學過程相關(guān)，并挖掘出每個模塊的關(guān)鍵節(jié)點基因；（2）發(fā)現(xiàn)UC和CD間在胺基糖代謝、O-Glycan合成、血管生成、B細胞受體信號通路上有顯著差異；（3）挖掘出12種潛在治療藥物。 結(jié)論 本文首次鑒定出IBD基因功能模塊，這些模塊可能代表疾病的主要特征，為疾病機制研究和藥物開發(fā)提供重要理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 炎癥性腸?。换蚬脖磉_網(wǎng)絡(luò)；潰瘍性結(jié)腸炎；克羅恩病

[中圖分類號] R574.1；Q933 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）09-0035-04

Construction and analysis of gene co-expression network of inflammatory bowel disease

YE Hua1 LIU Huiwei2 HUANG Shiliang1 ZHANG Xuesong1 HUANG Sha1 GAO Zhiqiang1 LIU Wei3 SONG Yufei1

1.Department of Gastroenterology， Ningbo University Affiliated Ningbo Medical Center Li Huili Hospital， Ningbo 315040，China； 2.Ningbo University School of Medicine， Ningbo 315211， China； 3.School of Life Science， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China

[Abstract] Objective To analyze inflammatory bowel disease（IBD） including Ulcerative colitis（UC） and Crohn's disease （CD） by using the systematic biology of co-expression networks，and to provide important information for disease mechanism research and drug development. Methods A total of 212 IBD RNA-Seq data in the public database were chosen as the study subjects. Construction of gene co-expression network was carried out by weighted gene co-expression network analysis （WGCNA） and the module data was analyzed by database for annotation， visualization and comprehensive discovery.The possible therapeutic drugs were screened using the drug-treated connectivity map （CMAP）. Results （1） A total of 12 biologically significant cofactor gene modules were identified. The function of the module was related to the biological processes such as immune response， angiogenesis， transcription， translation and energy metabolism， and the key node gene of each module was excavated； （2）There were significant differences in amino acid metabolism， O-Glycan synthesis， angiogenesis， B cell receptor signaling pathway between UC and CD； （3）12 kinds of potential treatment drugs were excavated. Conclusion The IBD gene functional modules were identified for the first time. These modules may represent the main characteristics of the disease and provide important theoretical basis for disease mechanism research and drug development.

[Key words] Inflammatory bowel disease； Gene co-expression network； Ulcerative colitis； Crohn's disease

炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）主要包括潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohns disease，CD），其發(fā)病機制尚未明確[1]。我國CD發(fā)病率超過0.03%，UC的發(fā)病率逐年上升[2，3]。IBD是多基因控制和環(huán)境影響共同作用導(dǎo)致的疾病，傳統(tǒng)的單基因研究方法不能提供基因表達全景圖，限制發(fā)病機制研究和有效藥物開發(fā)。二代測序技術(shù)的發(fā)展，使得獲得精確的基因表達數(shù)據(jù)成為可能，優(yōu)于傳統(tǒng)的基因芯片技術(shù)，為在系統(tǒng)水平研究IBD相關(guān)特征提供了支持。

使用谷歌學術(shù)等搜索引擎，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用基因共表達分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis，WGCNA）方法分析IBD二代測序數(shù)據(jù)的研究未見報道[4]。Costello等[5]對21個IBD樣本進行差異分析，發(fā)現(xiàn)細胞增殖基因在UC上調(diào)，滲透及結(jié)構(gòu)相關(guān)基因在CD上調(diào)，但未分析UC和CD間的差異；Granlund等[4]分析103個基因芯片數(shù)據(jù)，認為UC和CD間沒有顯著差異；Fang等[6]對公共數(shù)據(jù)庫中兒童IBD及小鼠模型數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)了一些共同的差異基因。最新研究發(fā)現(xiàn)，UC和CD間lncRNA的表達差異，其樣本量也較少[7]。上述研究樣本少，分析方法基于基因表達差異。本研究利用WGCNA的方法把上千個基因降維到若干個模塊，首次構(gòu)建IBD的基因共表達網(wǎng)絡(luò)，將其模塊化、簡單化，這些模塊代表IBD相關(guān)的生物學功能并利用大規(guī)模藥物的基因表達譜數(shù)據(jù)CMAP，篩選可能的治療IBD藥物。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)準備

從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫下載（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）GSE57945數(shù)據(jù)集，共有212個GSM文件來自UC和CD患者納入分析。數(shù)據(jù)來自Illumina HiSeq 2000測序平臺的單端測序數(shù)據(jù)，利用TopHat進行比對，Avadis NGS軟件進行定量（version 1.3.0，build 163982，Strand Scientific Intelligence Inc.）得到基因表達值（kilobase per million mapped reads，RPKM）。此數(shù)據(jù)用于后繼的基因共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

1.2 共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的參數(shù)設(shè)置

在R語言（Ver.3.2）下運行WGCNA包（Ver.1.51），進行基因共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與模塊鑒定。為了獲得有效的共表達網(wǎng)絡(luò)，只選取表達值FPKM值大于5，且變異系數(shù)大于10%的基因進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，共6423個基因?；蚬脖磉_網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建采用的參數(shù)如下：networkType=signed，softPower=12，minModuleSize =30，deepSplit=1.每個模塊的穩(wěn)定性以對212個樣本數(shù)據(jù)進行1000次隨機抽樣106個樣本，并計算隨機抽樣得到的模塊基因連接度，抽樣得到的連接度與原來的連接度進行相關(guān)分析，得到相關(guān)系數(shù)，抽樣獲得的1000個相關(guān)系數(shù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示。

1.3 功能富集分析

共表達網(wǎng)絡(luò)模塊內(nèi)各基因利用Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery（DAVID 6.7，https：//david-d.ncifcrf.gov/）在線工具進行基因本體（Gene Ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析。在DAVID中，條目的富集程度定義為Benjamini校正后的Fisher精確檢驗P值。

1.4 藥物表達譜分析

從Broad Institute CMAP下載藥物處理細胞株的表達芯片數(shù)據(jù)，Affymetrix Expression Console軟件分析，得到表達矩陣，將其映射到IBD共表達模塊，得到模塊的基因表達值ME（module eigengenes），根據(jù)ME值大小初步對可能的治療IBD藥物進行篩選。

2結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建炎癥性腸病的基因共表達網(wǎng)絡(luò)

本研究構(gòu)建了炎癥性腸病的基因共表達網(wǎng)絡(luò)。WGCNA方法可以檢測出14個穩(wěn)定的共表達模塊，每個模塊內(nèi)的基因具有相似的表達模式。為了證明這些模塊具有穩(wěn)定性，采用隨機抽樣的辦法，對抽樣前后每個模塊內(nèi)基因的連接度進行相關(guān)性分析，得到結(jié)果如表1所示。所有模塊的基因連接度相關(guān)性均值大于0.9，穩(wěn)定性最高的為模塊14，最低的為模塊7。

2.2 每個基因共表達模塊執(zhí)行不同的功能

為了解每個共表達模塊對應(yīng)的生物學功能，對其進行功能注釋。利用在線分析工具DAVID，獲取每個模塊最為顯著GO或KEGG注釋條目（表2）。因此，炎癥性腸病的共表達基因功能可以分解為這些相對獨立的模塊，幾乎每個模塊都和特定的生物學過程相關(guān)。比如，模塊12和血管生成相關(guān)，其編碼蛋白質(zhì)主要分布于細胞外基質(zhì)。模塊14參與翻譯，主要是細胞質(zhì)中核糖體蛋白編碼基因。

2.3 炎癥性腸病節(jié)點基因

在網(wǎng)絡(luò)中，處于中心位置的基因一般具有更為重要的功能。共表達網(wǎng)絡(luò)中處于中心的基因具有高的連接度。基因的連接度越高表明該基因在模塊中的重要性越大。通過連接度大小對基因的相對重要性排序，為實驗驗證基因功能提供信息。

2.4 共表達模塊在克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎中的表達差異分析

利用WGCNA分析得到的每個模塊的表達值，對12個共表達模塊在炎癥性腸病行了分析，發(fā)現(xiàn)有4個模塊在克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎中存在差異（P<0.05），分別是7、10、13和14模塊，分別和胺基糖代謝、O-Glycan合成、血管生成、B細胞受體信號通路相關(guān)，與CD相比，在UC分別是下調(diào)、下調(diào)、上調(diào)、上調(diào)（表4）。

2.5 共表達模塊可以用于治療藥物的發(fā)現(xiàn)

為了進一步驗證這些共表達模塊的重要性，使用藥物處理細胞系的基因芯片數(shù)據(jù)進行分析，得到每個模塊在不同藥物處理中的表達值，根據(jù)表達值大小可以進行排序，篩選潛在的治療藥物。

3 討論

WGCNA已經(jīng)被多個研究證明是有效的基因共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建方法，大量文獻無法一一列舉[8]。其應(yīng)用于人腦轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于不同腦區(qū)域的共表達模塊[9]。腫瘤中，WGCNA分析鑒定到了所有腫瘤細胞株保守的基因表達模塊，并具有臨床意義[10]。本文也采用該方法，對IBD二代測序轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，獲得了14個基因共表達模塊，其中12個模塊具有明確和顯著的生物學功能。傳統(tǒng)的基因芯片分析方法一般是尋找差異基因，或者多組數(shù)據(jù)進行ANOVA分析；當實驗數(shù)據(jù)成千上萬時，實驗條件也是千差萬別，使得人們難以入手分析；而WGCNA方法可降維數(shù)據(jù)，把上千個基因濃縮為數(shù)十個有用的模塊信息，彌補了常規(guī)分析方法的缺陷[11]。此外，獲得的模塊基因連接度信息可以為后繼實驗研究的候選基因篩選提供重要性信息，一個模塊中的高連接度基因往往發(fā)揮更為重要的作用[12]。本研究為實驗研究者提供了重要信息。

本文鑒定到的14個共表達基因模塊，其中12個具有明確的生物學功能。從系統(tǒng)生物學角度來說，可以用這些功能模塊來描述IBD相關(guān)的生物學功能，主要可分為免疫應(yīng)答、能量代謝、轉(zhuǎn)錄和翻譯等四大類（表2）。這些特征和已經(jīng)報道的IBD異常功能是相一致的。動物模型的研究表明腸道上皮細胞發(fā)生免疫應(yīng)答，導(dǎo)致抗炎和促炎失衡是IBD的可能機制[13]。IBD患者對能量需求比正常人高[14]，這可能和炎癥組織蛋白質(zhì)合成增強有關(guān)[15]。另外，UC中經(jīng)常有潰瘍發(fā)生，因而機體有血管生成的應(yīng)答[16]，但這可能和炎癥是相關(guān)的。我們鑒定到了血管生成基因的表達在UC和CD間是有差異的，而以往的規(guī)模較小的數(shù)據(jù)分析中往往認為二者沒有顯著差異[4]或樣本量較少[6，7]而缺乏效能。這提示UC和CD可能是2種類似但不同的疾病，其治療上也應(yīng)該有所區(qū)別，同時也說明WGCNA方法的有效性。但是，需要更大規(guī)模的患者數(shù)據(jù)來確認這個結(jié)果。

本研究為了進一步驗證這些模塊的重要性，利用已有的藥物芯片數(shù)據(jù)進行進一步的藥物挖掘。在藥物處理細胞表達數(shù)據(jù)集中進行了初步的藥物篩選，發(fā)現(xiàn)部分模塊受藥物作用影響。已有研究利用生物信息方法對IBD的藥物進行重新發(fā)現(xiàn)，其中有些藥物是用于治療消化道腫瘤用的[17]。我們發(fā)現(xiàn)模塊12（和血管生成相關(guān)）表達最低的是伊立替康處理的細胞，伊立替康可能會抑制血管生成，主要被用于結(jié)直腸癌伴IBD患者的治療[18，19]。模塊13（和免疫應(yīng)答相關(guān)）表達最低的是曲古抑菌素A處理的細胞，曲古抑菌素A是一種組蛋白乙?；敢种苿梢砸种颇[瘤細胞炎癥，也具有治療IBD的潛能[20]。這也為利用已有藥物治療IBD研究提供一定信息。后續(xù)的實驗研究可以優(yōu)先考慮這些藥物治療的動物實驗。

綜上，本文利用最新的系統(tǒng)生物學方法分析了IBD的基因共表達模塊，這些模塊反映了IBD的生物學特征，進一步利用藥物芯片數(shù)據(jù)庫挖掘潛在藥物，為相關(guān)研究人員進行發(fā)病機制和藥物治療研究提供寶貴信息。

[參考文獻]

[1] Wang YF，Ouyang Q，Hu RW.Progression of inflammatory bowel disease in China[J]. J Dig Dis，2010，11（2）：76-82.

[2] Leong RW，Lau JY，Sung JJ. The epidemiology and phenotype of Crohn's disease in the Chinese population[J]. Inflamm Bowel Dis，2004，10（5）：646-651.

[3] Zhao J，Ng SC，Lei Y，et al. First prospective，population-based inflammatory bowel disease incidence study in mainland of China：The emergence of "western" disease[J]. Inflamm Bowel Dis，2013，19（9）：1839-1845.

[4] Granlund A，F(xiàn)latberg A，Ostvik AE，et al. Whole genome gene expression meta-analysis of inflammatory bowel disease colon mucosa demonstrates lack of major differences between Crohn's disease and ulcerative colitis[J]. PLoS One，2013，8（2）：e56818.

[5] Costello CM，Mah N，Hasler R，et al. Dissection of the inflammatory bowel disease transcriptome using genome-wide cDNA microarrays[J]. PLoS Med，2005，2（8）：e199.

[6] Fang K，Grisham MB，Kevil CG. Application of Comparative Transcriptional Genomics to Identify Molecular Targets for Pediatric IBD[J]. Front Immunol，2015，6：165.

[7] Mirza AH，Berthelsen CH，Seemann SE，et al. Transcriptomic landscape of lncRNAs in inflammatory bowel disease[J]. Genome Med，2015，7（1）：39.

[8] Fuller T，Langfelder P，Presson A，et al. Review of weighted gene coexpression network analysis[J]. Handbook of Statistical Bioinformatics：Springer，2011：369-388.

[9] Oldham MC，Konopka G，Iwamoto K，et al.Functional organization of the transcriptome in human brain[J]. Nat Neurosci，2008，11（11）：1271-1282.

[10] Liu W，Li L，Li W. Gene co-expression analysis identifies common modules related to prognosis and drug resistance in cancer cell lines[J]. Int J Cancer，2014，135（12）：2795-2803.

[11] Langfelder P，Horvath S. WGCNA：An R package for weighted correlation network analysis[J]. BMC Bioinformatics，2008，9（1）：559.

[12] Horvath S，Zhang B，Carlson M，et al. Analysis of oncogenic signaling networks in glioblastoma identifies ASPM as a molecular target[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2006， 103（46）：17402-17407.

[13] Brown SJ，Mayer L. The immune response in inflammatory bowel disease[J]. Am J Gastroenterol，2007，102（9）：2058-2069.

[14] Barot LR，Rombeau JL，F(xiàn)eurer ID，et al. Caloric requirements in patients with inflammatory bowel disease[J]. Ann Surg 1982，195（2）：214-218.

[15] El Yousfi M，Breuille D，Papet I，et al. Increased tissue protein synthesis during spontaneous inflammatory bowel disease in HLA-B27 rats[J]. Clin Sci（Lond），2003，105（4）：437-446.

[16] Danese S，Sans M，de la Motte C，et al. Angiogenesis as a novel component of inflammatory bowel disease pathogenesis[J]. Gastroenterology，2006，130（7）：2060-2073.

[17] Clark PM，Dawany N，Dampier W，et al. Bioinformatics analysis reveals transcriptome and microRNA signatures and drug repositioning targets for IBD and other autoimmune diseases[J]. Inflamm Bowel Dis，2012，18（12）：2315-2333.

[18] Jauregui-Amezaga A，Vermeire S，Prenen H. Use of biologics and chemotherapy in patients with inflammatory bowel diseases and cancer[J]. Ann Gastroenterol，2016，29（2）：127-136.

[19] Goessling W，Mayer RJ. Systemic treatment of patients who have colorectal cancer and inflammatory bowel disease[J]. Gastroenterol Clin North Am，2006，35（3）：713-727.

[20] Edwards AJ，Pender SL. Histone deacetylase inhibitors and their potential role in inflammatory bowel diseases[J].Biochem Soc Trans，2011，39（4）：1092-1095.

（收稿日期：2016-12-03）