EMS不同處理濃度和時間對紅小豆誘變的影響

劉建霞，溫日宇，劉文英，梁彩霞

（1.山西大同大學生命科學學院，山西大同037009；2.山西省農業科學院玉米研究所，山西忻州034000）

EMS不同處理濃度和時間對紅小豆誘變的影響

劉建霞1，溫日宇2，劉文英1，梁彩霞1

（1.山西大同大學生命科學學院，山西大同037009；2.山西省農業科學院玉米研究所，山西忻州034000）

為了利用誘變育種技術快速地對紅小豆種子進行遺傳改良，在短時間內獲得更多的優良變異類型，利用0.0%，0.3%，0.5%，0.7%，1.0%，1.5%的EMS對紅小豆種子進行處理，處理時間為5，10，15，20 h，以探討不同濃度和時間EMS對紅小豆種子發芽率的影響國；同時，還對其SOD，POD的活性變化進行了探索。結果表明，EMS誘變的最佳組合為濃度0.7%、處理時間20 h；EMS對種子及幼苗的SOD活性表現為明顯增強，而POD的活性表現為低濃度促進、高濃度抑制。

甲基磺酸乙酯（EMS）；發芽率；紅小豆

紅小豆（Vigna angrlaris）屬于豆科植物，也有人叫它赤小豆、亦豆、朱赤豆等，紅小豆一般為細長形、橢圓形，長大約為5～6 mm，表面一般顯示為暗棕紅色，在其側邊有白色的種臍。紅小豆營養價值極高，在全國范圍內普遍栽種，分布廣泛，是全民性的食品[1-3]。

紅小豆的主要化學成分有三萜皂甙、膳食纖維、多種脂肪酸、糖類、甾醇、部分微量元素，還含有多種無機鹽成分等。作為一種膳食纖維，其具有潤腸通便，調節人體血糖、血脂的功效，還具有預防膽結石、幫助減肥等功效；含有皂角苷，能除惡毒、消腫痛；紅小豆中富含葉酸，對乳汁不通的孕婦有催乳的作用；此外，還能夠刺激腸道，利小便。所以，多吃紅小豆對于健脾養胃、補血養血、清熱解毒有很好的療效。紅小豆目前的研究，主要涉及遺傳多樣性、分類學等基礎性的生物學方面[4-5]。紅小豆育種研究始終舉足輕重，其中無論是傳統的還是現代的育種技術都起到了極其重要的作用。

使用EMS作為誘變劑進行誘變，因其操作簡單，效果穩定，不易產生回復突變，突變類型廣，能誘發產生高密度的系列等位基因點突變，且對染色體損傷小，是植物誘變育種中使用效果相對比較好的一種誘變劑[6-10]。EMS誘變育種研究中一個重要環節是誘變親本材料及部位的選擇，一般選擇便于操作并且對誘變較敏感的器官作為誘變處理的部位[11-13]。種子是最早也是最常被用來作為EMS誘變處理的材料。

本試驗以甲基磺酸乙酯（EMS）為誘變劑，研究不同處理濃度和時間對紅小豆種子發芽率和發芽勢的影響，以期為紅小豆育種提供可靠的理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

本試驗所選用的紅小豆種子由山西省農業科學院高寒區作物研究所提供；甲基磺酸乙酯（EMS）購自上海潛度生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 EMS誘變處理方法從試驗材料中選取顆粒飽滿的紅小豆種子6 400顆；先用沸水燙種30 s，倒掉沸水，加入清水浸種15 h（溫度22℃）；將浸好的種子平均分配到128個培養皿中，分別用0.0%，0.3%，0.5%，0.7%，1.0%，1.5%的EMS處理5，10，15，20 h；誘變劑用0.1 mol/L的磷酸緩沖液作為溶劑溶解。為了去除種子上殘留的EMS溶液，需要用流水對其沖洗，2 h即可；然后將處理好的種子轉至事先準備好的培養基中（鋪有雙層濾紙），置于恒溫培養箱中培養，溫度設定為23℃左右，定期觀察并統計發芽的種子數，調查7 d的發芽率；同時以不添加誘變劑的為對照組（CK），設置2個重復以保證試驗結果的可靠性。

1.2.2 酶液提取取0.5 g的葉片于預冷的研缽中，加6 mL濃度為0.2 mol/L的磷酸緩沖液（pH＝7.8）進行充分地研磨，形成勻漿狀；然后加入緩沖液進行定容，定容至10 mL即可；然后以4 000 r/min離心20 min，上清液即為需要的酶的粗提取液。

1.2.3 SOD活性測定取10 mL試管4支，其中，2支為對照管，均加入0.05 mol/L的磷酸緩沖液（pH＝7.8）3 mL，130 mmol/L的Met溶液0.6 mL，750 μmol/L NBT溶液0.6 mL，100 μmol/L EDTA溶液0.6 mL，20 μmol/L核黃素0.6 mL，蒸餾水1.0 mL，酶液0.2 mL（對照組以失活酶代替），總體積為6.6 mL，將一支對照管放于黑暗處，其余各管均放在4 000 lx光照下反應20 min。

1.2.4 POD活性測定取10 mL試管4支，其中，1支為對照管，其余各管為試驗管，各管均加入反應混合液3 mL，對照管加失活酶液1 mL，試驗管加粗酶提取液1 mL；然后在470 nm下測定其OD值，用秒表計時，每隔20 s記錄一次，連續讀3次。

2 結果與分析

2.1 EMS對紅小豆發芽率、相對發芽率的影響

從表1可以看出，隨著EMS濃度的增大、處理時間的延長，紅小豆的發芽均呈現出下降的趨勢，與已有研究結果一致[6-8]。當EMS濃度達到1.5%、處理時間為20 h時，紅小豆的發芽率由對照組的74%降到8%，說明紅小豆對EMS是比較敏感的；隨著EMS濃度和時間的增加，紅小豆的相對發芽率呈現逐漸降低的趨勢，當EMS濃度為0.7%、時間為20 h時，紅小豆的相對發芽率為51.35%，接近半致死量，由此得出，EMS的最佳誘變組合為0.7%，20 h。

表1 不同濃度和時間的EMS對紅小豆發芽的影響

2.2 EMS處理對紅小豆幼苗POD，SOD活性的影響

POD（過氧化物酶）、SOD（超氧化物歧化酶）以及CAT（過氧化氫酶）等是植物逆境生物學研究的主要對象，它們之間的協同作用可防御活性氧或其他過氧化物自由基對細胞膜系統的傷害。POD是植物體內普遍存在且活性較高的一種酶，與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等生理代謝過程密切相關，在植物生長發育過程中，活性不斷發生變化，POD的活性可反映這一時期植物體內代謝的變化[14]。

從圖1可以看出，隨著EMS濃度的增加，紅小豆葉片POD活性呈現為先增加后降低的趨勢，當EMS濃度為0.7%時POD活性達到最大，而當濃度超過0.7%時，酶活性逐漸下降。說明在EMS誘變濃度和時間適度時，POD的抗氧化活性增強。

SOD是一種含金屬酶，普遍存在于需氧生物體內，參與氧的代謝，可以催化超氧陰離子發生歧化反應形成過氧化氫，過氧化氫又可以被CAT轉化成無害的氧和水或者被POD利用[14]。由圖2可知，紅小豆幼苗SOD活性隨著EMS濃度的增加，整體上呈現上升的趨勢。說明紅小豆幼苗可以利用自身的防護機制來適應EMS脅迫下的有害環境，EMS作用的濃度和時間未達到SOD活性下降乃至于逐漸失活的水平。

3 結論與討論

3.1 EMS對紅小豆種子發芽的最適誘變濃度和時間

已有大量研究表明，EMS作為誘變劑對種子發芽情況具有一定的影響。姜莉等[15]研究了EMS對甜菜種子誘變致死率的影響，結果確定10 h，2.5%和12 h，2.3%的EMS處理是比較好的誘變組合。慎家輝等[11]研究了甲基磺酸乙酯對杜梨種子誘變導致突變的鑒定與分析，結果篩選出最適宜的EMS處理濃度為0.4%，變異率為37.3%。張凱[14]用不同濃度和時間的EMS處理頭花蓼，結果得出，EMS誘變頭花蓼種子的最適誘變濃度和時間為0.6%，24 h和0.8%，12 h，經過處理的頭花蓼播種成苗后存在廣泛變異，誘變后植株生長加快、花青素含量降低。云娜等[16]用EMS對蒙紅豆草進行誘變，結果得出，EMS處理對蒙紅豆草莢果出苗進程具有延遲和抑制作用。曲高平等[17]用EMS對甘藍油菜種子進行處理，結果得出，隨著EMS濃度的增大，發芽率降低，發芽時間延長。由上述研究可知，EMS對不同種類的種子敏感度不同，處理后的效果可能為促進、抑制或者不影響。

本試驗結果表明，疊氮化鈉對紅小豆最佳誘變組合為1.0 mmol/L，3 h；EMS對紅小豆發芽的影響為抑制，且隨著EMS濃度的增加，其發芽率、相對發芽率均降低，最佳誘變組合為0.7%，20 h；EMS處理時SOD活性會明顯提高，而高濃度的EMS處理時POD活性表現為抑制、低濃度時表現為促進，且在EMS濃度為0.7%時酶活性達到了最大值。盧銀等[18]用EMS處理大白菜種子，結果表明，對主要生化指標POD和SOD的活性檢測具有協同效應，即低濃度表現為酶活性提高，高濃度酶活性抑制；而本試驗中，EMS的處理時間和處理濃度可能還沒有達到抑制SOD活性的水平，一直表現為高活性，是由于生物個體的差異還是其他方面的原因仍有待進一步研究。

3.2 影響種子發芽率因素的探究[19-22]

在試驗時要對種子進行熱燙，本試驗是熱燙30 s，然后再用自來水浸泡15 h，但對于最適合的熱燙時間和浸泡時間及浸泡溫度仍待進一步探究。

本研究試驗時，紅小豆會發生霉變，原因可能是由于紅小豆種子本來就帶菌，未對紅小豆進行消毒處理，在培養過程中發生霉變，導致發芽率降低，影響試驗結果的準確性。另一方面，在浸泡和培養過程中用的是自來水，自來水中也含有微生物，從而導致霉變。除此之外，隨著培養時間的延長，種皮被破壞，也會加速種子的霉變。

在本試驗過程中，選用20 mL的EMS溶液誘變種子，紅小豆種子稍過大，可能未完全浸泡，誘變不充分。在配制EMS溶液時，使用的是0.1mol/L的磷酸緩沖液（pH＝7），磷酸緩沖液要現用現配，以免失效。

本試驗紅小豆在25℃培養箱中培養，但對于最佳的培養溫度仍待進一步研究。配反應混合液加H2O2時，要等到溶液冷卻后才可加入，否則會引起分解，影響試驗結果的準確性。

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Effect of Different Concentrations and Time EMS on Mutagenesis of Adzuki Bean

LIUJianxia1，WENRiyu2，LIUWenying1，LIANGCaixia1
（1.College ofLife Science，DatongUniversityin Shanxi，Datong 037009，China；2.Institute ofMaize，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Xinzhou 034000，China）

Tomake use ofthe mutation breedingfor genetic improvement ofadzuki bean seeds fast,and get more excellent variation types in a short time,these adzuki bean be treated in different time（5,10,15,20 h）and concentration（0.0%,0.3%,0.5%,0.7%,1.0%, 1.5%）of EMS to explore the effect on germination rate of adzuki bean seed sprout,and the suitable EMS dosage.In addition,the SOD, POD activity changes were studied.The results showed that the best combination of EMS mutagenesis was EMS concentration of 0.7%, tratment time of20 h,and EMSon seed and seedlingofSODactivitysignificantlyincreased,the activityofPOD showed lowconcentration promoted and high concentration inhibited.

EMS;germination rat;red bean

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.05.10

S521

：A

：1002-2481（2017）05-0715-04

2016-10-28

山西省科技攻關項目（20140311005-3）

劉建霞（1977-），女，山西朔州人，講師，主要從事食用豆種質資源的創新與利用研究工作。