擬南芥At2g23470基因T-DNA插入突變體的鑒定

李斯琪，宋欣，趙淑清

（山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西太原030006）

擬南芥At2g23470基因T-DNA插入突變體的鑒定

李斯琪，宋欣，趙淑清

（山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西太原030006）

At2g23470是擬南芥功能未知結(jié)構(gòu)域DUF647蛋白家族的一個成員。為了研究At2g23470基因的功能，需要獲得At2g23470功能缺失的突變體材料。根據(jù)擬南芥信息資源網(wǎng)站（The Arabidopsis Information Resource，TAIR）上公布的At2g23470基因可利用的T-DNA標(biāo)簽品系，從美國擬南芥生物資源中心（Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC）購買了2套獨立的At2g23470基因的T-DNA插入GABI-Kat株系種子，運用PCR法對這些T-DNA插入突變體進(jìn)行了基因型分析和鑒定，結(jié)果獲得了3個純合的T-DNA插入位于RUS4啟動子上的株系和1個T-DNA插入位于第2外顯子的株系。RT-PCR分析表明，T-DNA插入位于第2外顯子的株系中，At2g23470基因的表達(dá)完全缺失。該突變材料的獲得為深入研究At2g23470基因的功能奠定了良好的基礎(chǔ)。

擬南芥；GABI-Kat株系；T-DNA

At2g23470是擬南芥功能未知結(jié)構(gòu)域DUF647蛋白家族的一個成員[1]。根據(jù)TAIR的最新注釋，At2g23470基因參與的生物學(xué)過程以及分子功能完全未知（Biological process unknown；Molecular function unknown）。FlowerNet數(shù)據(jù)顯示，At2g23470在花發(fā)育后期的花組織和花粉中有中等水平的表達(dá)[2]。我們通過人工microRNAs（artificial microRNAs，amiRNAs）技術(shù)獲得了特異沉默At2g23470基因的突變體[3]。At2g23470-amiRNA突變體由于自花授粉失敗而產(chǎn)生短小的角果，但是通過人工授予有活力的花粉可以挽救其不育表型，提示At2g23470是一個與花粉發(fā)育相關(guān)的基因。

花粉形成和釋放通常涉及到基因組中1/2以上的基因表達(dá)。高頻率的基因突變導(dǎo)致雄性不育，足以說明基因組參與花藥和花粉發(fā)育的程度。花粉發(fā)育和（或）花藥開裂的缺陷均可引起雄性不育。近年來，通過對擬南芥雄性不育突變體的研究，已經(jīng)鑒定了大量參與花粉形成和釋放的基因，使人們對花藥和花粉發(fā)育的機(jī)制有了更好的理解[4-10]。然而，目前對控制植物花藥發(fā)育和花粉發(fā)生分子機(jī)制的認(rèn)知仍然不全面，意味著還有許多作用于花藥發(fā)育過程的基因有待于被發(fā)現(xiàn)和鑒定。

根據(jù)山西大學(xué)植物生殖發(fā)育研究組對At2g 23470-amiRNA突變體的研究顯示，At2g23470基因可能參與花藥和花粉的發(fā)育過程。為了深入研究At2g23470基因的功能，需要獲得At2g23470基因敲除突變體。本研究從美國俄亥俄州立大學(xué)擬南芥生物資源中心購買了分別在At2g23470基因啟動子和外顯子上有T-DNA插入的2套GABI-Kat插入系，對其基因型進(jìn)行了分析鑒定，結(jié)果獲得并證實了4個純合的T-DNA插入株系，旨在為進(jìn)一步研究At2g23470基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料擬南芥（Arabidopsis thaliana）T-DNA插入株系（Columbia，Col-0生態(tài)型）種子購自美國俄亥俄州立大學(xué)擬南芥生物資源中心（Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC）；野生型擬南芥（Columbia，Col-0生態(tài)型）種子由山西大學(xué)生物技術(shù)研究所趙淑清課題組保存。

1.1.2 生物學(xué)試劑EasyTaq DNA聚合酶、dNTPs購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；RNAiso Plus和PrimeScriptTMII RT試劑盒以及TaKaRa Ex Taq購自寶生物工程（大連）有限公司。瓊脂糖為BBI生命科學(xué)有限公司產(chǎn)品，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 材料種植擬南芥種子在4℃春化3 d后播種于營養(yǎng)土∶蛭石為3∶1（V/V）的混合土中。培養(yǎng)時先用1/4 Hoagland營養(yǎng)液把土浸透，種植后覆蓋塑料膜以保持濕度；當(dāng)擬南芥種子萌發(fā)10 d后去掉塑料膜。培養(yǎng)條件為：溫度18～22℃，濕度50%～70%，光暗周期16 h/8 h。

1.2.2 植株基因組DNA的提取采用蔗糖法[11-14]提取擬南芥基因組DNA，略做改動。收集生長14 d左右的擬南芥幼葉樣品（直徑2～3 mm）于冰置的100 μL的蔗糖溶液（50 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5，300 mmol/L NaCl，300 mmol/L蔗糖）中，用槍頭將葉片壓碎。在PCR儀上99℃加熱10 min，然后6 000 g瞬時離心。用1 μL上清進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.3 基因型分析過程和引物的詳細(xì)信息基因型分析At2g23470基因T-DNA插入突變體是利用T-DNA特異的左邊界引物（BP）和跨越插入位點兩側(cè)的At2g23470基因座位特異的引物（LP和RP）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。首先，利用T-DNA邊界特異的引物8474和At2g23470基因座位特異引物（RP），通過PCR確認(rèn)插入特異的產(chǎn)物。然后，利用插入位點兩側(cè)的At2g23470基因座位特異的引物（LP和RP）進(jìn)行PCR確認(rèn)。在野生型中，LP和RP擴(kuò)增出At2g23470特異的PCR產(chǎn)物。純合的T-DNA株系只有BP和RP擴(kuò)增出插入PCR產(chǎn)物，雜合子則會產(chǎn)生以上2種產(chǎn)物，即插入PCR產(chǎn)物和At2g23470特異的PCR產(chǎn)物（圖1）。GABI-Kat系T-DNA的左邊界引物BP是8474。對CS433066 T-DNA插入系，At2g23470基因座位特異引物為CS433066-LP，CS433066-RP和BB40；對CS442878插入系，At2g23470基因座位特異引物為CS442878-LP，CS442878-RP和JH21。以樣本DNA為模板，分別以8474-BB40和CS433066-LP，CS433066-RP以及8474-JH21和CS442878-LP，CS442878-RP為組合引物進(jìn)行PCR。引物序列列于表1。

表1 T-DNA插入基因型分析的引物信息

LP和RP是T-DNA植物基因組上T-DNA插入位點兩側(cè)目的基因座位特異的引物，8474是GABI-Kat插入系T-DNA區(qū)段上左邊界引物。經(jīng)過PCR，野生型用LP和RP擴(kuò)增出預(yù)期大小的目的基因特異的PCR產(chǎn)物；純合的T-DNA株系只有BP（8474）和RP能擴(kuò)增出插入PCR產(chǎn)物；雜合子則會產(chǎn)生2種產(chǎn)物。1.2.4PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測PCR反應(yīng)體系：模板DNA 1 μL，正向引物（10 μmol/L）0.25 μL，反向引物（10 μmol/L）0.25 μL，10×EasyTaq buffer 1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.8 μL，EasyTaq DNA聚合酶0.2 μL，雙蒸水6.5 μL，總體積10 μL，混勻后進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸90 s，35次循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所用的電泳緩沖溶液為1×TBE，用4SGreen進(jìn)行染色，電泳電壓為5 V/cm。電泳結(jié)果用GDS凝膠圖像處理系統(tǒng)照相記錄。1.2.5RNA提取和RT-PCR分析利用TaKaRa的RNAiso Plus試劑提取擬南芥野生型與待檢測T-DNA插入株系葉片的RNA。用NanoDrop 2000超微量分光光度計測定RNA的濃度。利用Prime-ScriptTMII RT試劑盒對2 μg的RNA合成cDNA。然后，利用At2g23470基因的特異引物At2g23470-F（5′-GGTTTGGCCCATCAGAATCG-3′）和At2g23470-R（5′-GCTCCTTCGCGCAGACAAAT-3′）進(jìn)行RTPCR檢測At2g23470的表達(dá)。ACTIN2基因作為內(nèi)參，ACTIN2引物序列為ACTIN2-F：5′-GGTGATGG TGTGTCTCACACTG-3′；ACTIN2-R：5′-GAGGTTTC CATCTCCTGCTCGTAG-3′。擴(kuò)增條件：94℃3 min；94℃3 min，58℃30 s，72℃1 min，25個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CS433066 GK-345D06 T-DNA插入突變體的鑒定

為了鑒定擬南芥在At2g23470基因座位上的T-DNA插入突變體，篩選了美國擬南芥生物資源中心（ABRC）2個獨立的T-DNA插入系CS433066和CS442878，其分別攜帶T-DNA插入在啟動子和第2個外顯子上。

首先，對CS433066插入系一套4個獨立的T4株系進(jìn)行了PCR鑒定，這4個株系的ABRC編號分別為：CS730617，CS730621，CS730622和CS730623。利用引物T-DNA左邊界引物8474和At2g23470基因座位特異引物BB40對CS730617，CS730621和CS730623株系的鑒定結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，CS730617株系10個單株、CS730621株系10個單株和CS730623株系10個單株均得到了清晰的插入特異性擴(kuò)增條帶，產(chǎn)物大約為700 bp。然后，對這3個株系的單株DNA樣品利用T-DNA插入兩端的CS433066-LP和CS433066-RP引物進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，其結(jié)果如圖3所示，野生型樣品有預(yù)測的1 083 bp大小的At2g23470特異的PCR產(chǎn)物，其余各株系樣品均沒有擴(kuò)增條帶，說明這些植株在該位點有T-DNA插入。由圖2，3可知，CS730617，CS730621和CS730623株系為純合的T-DNA插入突變體；而CS730622株系樣品，利用引物8474和BB40沒有擴(kuò)增條帶，但利用CS433066-LP和CS433066-RP引物擴(kuò)增有At2g23470特異的PCR產(chǎn)物，說明CS730622株系為野生型。在T-DNA插入的T4種子中，單獨的株系對于插入有可能是野生型、雜合體和突變體；通過PCR鑒定，獲得了3個純合的CS433066 GK-345D06 T-DNA插入株系，即CS730617，CS730621和CS730623。

2.2 CS442878 GK-447F02 T-DNA插入突變體的鑒定

對T-DNA插入株系CS442878 GK-447F02進(jìn)行了PCR鑒定，利用T-DNA左邊界引物8474和At2g23470基因座位特異引物JH21對ABRC編號為CS305242株系的鑒定結(jié)果如圖4-A所示，野生型沒有擴(kuò)增條帶，CS305242株系18個樣品全部有插入條帶，產(chǎn)物大小約500 bp；然后，對這個株系的單株DNA樣品，利用T-DNA插入兩端的At2g23470基因特異的引物CS442878-LP和CS442878-RP進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，其結(jié)果如圖4-B所示，野生型樣品有預(yù)期的大小為1 193 bp的At2g23470特異的PCR產(chǎn)物，其余各單株樣品均沒有擴(kuò)增條帶，說明這些植株在該位點有T-DNA插入。可以確定CS305242株系為純合的T-DNA插入突變體。

2.3 RT-PCR分析At2g23470基因在T-DNA突變體中的表達(dá)

對篩選到的CS730617，CS730621，CS730623和CS305242 T-DNA插入突變體，采用半定量RT-PCR，利用At2g23470特異的引物進(jìn)行了基因表達(dá)分析，結(jié)果顯示，在CS730617，CS730621，CS730623等3個株系中，At2g23470基因的表達(dá)并沒有降低，似乎還有所升高，表明在基因啟動子上的T-DNA插入并不一定會引起基因的失活，還有可能引起一定程度的激活（圖5-A）。在CS305242 T-DNA插入突變體中，At2g23470基因幾乎檢測不到，表明T-DNA插入使得CS305242突變體中At2g23470基因完全被敲除（圖5-B），這一材料是At2g23470基因的功能缺失突變體。

3 討論

隨著許多物種基因組測序計劃的完成，反向遺傳學(xué)已經(jīng)成為研究基因功能的一種有效途徑[15-17]。反向遺傳學(xué)是從選擇一個已知基因的序列出發(fā)，通過對靶基因進(jìn)行必要的加工和修飾，如定點突變、基因插入/缺失和基因干擾等，以期獲得該基因突變產(chǎn)生的突變體表型，然后根據(jù)突變體表型的變化深入研究該基因的功能。目前，在模式植物擬南芥中已經(jīng)創(chuàng)造出大量的T-DNA插入突變體，主要有SALK庫和GABI-Kat庫[18-21]，而且可以很方便地購買到這些突變體種子。但從突變體庫中獲得種子后，首先需要對突變體進(jìn)行基因型分析，從而獲得純合的突變體。因為本研究所購買到的T-DNA插入突變體種子只是從T2親代確認(rèn)含有T-DNA插入的T3產(chǎn)生的T4獨立株系，每一個株系可能是野生型、雜合體或純合體，必須進(jìn)行基因型分析鑒定。

本研究通過基于PCR基因型分析基因組DNA的方法，獲得了3個純合的T-DNA插入位于At2g23470啟動子上的突變體和1個DNA插入位于At2g23470外顯子上的突變體。RT-PCR分析結(jié)果表明，突變體中At2g23470基因在第2外顯子上的T-DNA插入造成了無效突變，At2g23470在轉(zhuǎn)錄水平已完全沒有表達(dá)，該突變體可以用于At2g23470基因功能的深入研究。然而，在At2g23470啟動子上的T-DNA插入，并沒有引起At2g23470基因表達(dá)的降低，似乎還有所升高，表明在基因啟動子上的T-DNA插入并不一定會引起基因的失活，還有可能引起一定程度的激活，這種現(xiàn)象在許多啟動子上的T-DNA插入突變體中比較常見。本研究獲得的At2g23470敲除的T-DNA突變材料為研究At2g23470基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

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Identification of Arabidopsis T-DNA Insertion Mutants atAt2g23470Locus

LI Siqi，SONGXin，ZHAOShuqing
（Institute ofBiotechnology，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

At2g23470 is a member of the Domain of Unknown Function 647 protein family that is conserved in diverse eukaryotic organisms.To identify Arabidopsis T-DNA insertion mutants at the At2g23470 locus,we screened the ABRC collections.Two independent T-DNA lines carrying a T-DNA insertion either at the promoter or in the second exon,respectively,were genotyped using PCR-based analysis of genomic DNA.RT-PCR of homozygous T-DNA insertion mutants,using At2g23470-specifc primers,exhibited increased At2g23470 transcript levels in homozygous mutants with insertion at the promoter;whilst At2g23470 transcripts could not be detected in the homozygous mutant with T-DNA insertion at the exon,indicating that it contains a null mutation in the At2g23470 gene. These homozygous mutants have laid a foundation for investigating the function of At2g23470 gene in Arabidopsis growth and development.

Arabidopsis;GABI-Kat lines;T-DNA

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.05.03

Q943.2

：A

：1002-2481（2017）05-0684-05

2017-02-17

國家自然科學(xué)基金項目（31170273）；山西省回國留學(xué)人員科研資助項目（2015）

李斯琪（1991-），女，山西夏縣人，在讀碩士，研究方向：植物分子生物學(xué)。趙淑清為通信作者。