擬南芥35S:MS606/myb26轉基因植物的鑒定

宋欣，趙淑清

（山西大學生物技術研究所，山西太原030006）

擬南芥35S:MS606/myb26轉基因植物的鑒定

宋欣，趙淑清

（山西大學生物技術研究所，山西太原030006）

ms606是山西大學植物生殖發育實驗室創制的雄性不育突變體，該突變體具有藥室內壁次生加厚缺陷，導致花藥不能開裂。而轉錄因子MYB26在藥室內壁次生加厚過程中發揮著重要的調控作用。為了研究MS606和MYB26之間的關系，我們將35S：MS606融合基因在農桿菌介導下轉化植物myb26/MYB26雜合體，通過潮霉素抗性篩選，結果獲得T1轉化植株；并通過在基因組水平的PCR檢測和RNA水平的半定量RT-PCR檢測，獲得純合的35S：MS606/myb26轉基因植株。該材料的獲得為深入研究MS606和MYB26基因在調控藥室內壁次生加厚途徑中的關系奠定了良好基礎。

擬南芥；轉基因；MS606；MYB26；基因表達

植物轉基因技術是采用基因工程手段將外源基因重組到植物表達載體，然后轉入植物中，使新基因在植物細胞內整合、表達，并能將外源基因遺傳給后代，由此獲得基因改良植物，使之穩定遺傳并賦予植物新的性狀[1]。這一技術克服了植物有性雜交的限制，使基因交流的范圍無限擴大，是進行基因功能研究和植物遺傳改良的重要工具。自1986年世界上第1例轉基因植物問世以來，轉基因植物迅猛發展，在抗蟲、抗病、抗逆、高產、優質等方面取得了一定的成就[2-3]。

花藥發育和花粉形成是植物完成世代交替的重要環節，而花粉粒作為植物的雄配子體，在有性生殖過程中發揮著重要作用。擬南芥與大多數開花植物相同，花藥壁由表皮、藥室內壁、中層和絨氈層4個細胞層組成[4]?；ㄋ庨_裂是一個極其復雜的過程，包括表皮薄弱處細胞溶解產生裂口，花藥壁的回縮使裂口加寬以釋放花粉等事件。在野生型中，藥室內壁里纖維素和木質素合成積累產生次生加厚[5-6]，藥室內壁的次生加厚在花藥開裂過程中起著關鍵作用，可為花藥開裂提供一種機械力量：首先藥室內壁細胞膨脹使裂口開裂，隨后藥室內壁干燥脫水使細胞壁特異收縮。

MYB26是花藥中以細胞特異的模式調控藥室內壁發育和次生加厚的一個關鍵因子[7-9]。在myb26突變體中，藥室內壁細胞的擴張和次生加厚發生異常，隨后的藥室內壁也沒有收縮，導致花藥不開裂不能釋放花粉。MYB26過表達導致擬南芥表皮組織異位次生加厚[9]。MYB26作用于木質素合成途徑的上游，通過調節次生加厚相關基因IRREGULAR XYLEM1（IRX1），IRX3，IRX8和IRX12，NAC SECONDARY WALL THICKENING PROMOTING FACTOR1（NST1）和NST2等的表達，進而調節次生加厚的過程[9]。ms606是山西大學植物生殖發育實驗室創制的擬南芥雄性不育突變體，該突變體由于自花授粉失敗而產生短小的角果，但是通過人工授予有活力的花粉可以挽救其不育表型。前期的試驗結果顯示，ms606植株花藥開裂也存在缺陷。

本研究利用山西大學植物生殖發育實驗室構建的35S啟動子驅動的融合MS606 cDNA的植物表達載體pGWB5-MS606，通過農桿菌EHA105介導，用花苞浸染法轉化了雜合的myb26/MYB26突變體，并對轉基因植物進行基因組水平的PCR檢測和RNA水平的半定量RT-PCR檢測，旨在得到純合的35S：MS606/myb26轉基因植物，以便確定過表達MS606是否對myb26的表型產生影響，從而探討擬南芥MS606和MYB26基因在調控花藥發育尤其是藥室內壁次生加厚過程中的關系，對于進一步提高人們對花粉發育生物學過程的認識具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）myb26突變體（SALK_112372，Columbia，Col-0生態型）是從英國諾丁漢擬南芥種子庫中心獲得。

野生型擬南芥（Columbia，Col-0生態型）種子由山西大學植物生殖發育實驗室保存。培養條件：溫度18～22℃，濕度50%～70%，光暗周期16 h/8 h。1.1.2菌株和質粒pGWB5-MS606由山西大學植物生殖發育實驗室構建，農桿菌EHA105感受態細胞由山西大學植物生殖發育實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 人工雜交獲得myb26/MYB26雜合體以擬南芥突變體myb26植株作為母本、野生型作為父本，當myb26植株花蕾剛剛露白時，小心剝去花萼、花瓣和雄蕊，露出雌蕊，取剛盛開的野生型花的雄蕊，授粉到myb26植株的雌蕊柱頭上并做好標記。對雜交成功的角果，成熟后單獨收獲。

1.2.2 pGWB5-MS606重組質粒轉化擬南芥myb26/ MYB26雜合體

1.2.2.1 感受態農桿菌EHA105的轉化采用液氮凍融方法[10]將pGWB5-MS606質粒轉入農桿菌EHA105中，在含（Rif 50 mg/L和Kan 50 mg/L）抗性的LB固體培養基上篩選陽性克隆，并用PCR法鑒定。

1.2.2.2 花苞浸染法轉化擬南芥植株將經過鑒定的pGWB5-MS606重組質粒采用農桿菌介導的花苞浸染法[11]轉化擬南芥myb26/MYB26雜合體。轉化步驟參照CLOUGH等[12]的研究方法，即取2 mL菌液接種于加有相同抗性的200 mL LB液體培養基中，28℃200 r/min振蕩培養至OD260＝1.0。離心后，去上清，菌體重懸浮于5%蔗糖溶液中，加入Sliwet L-77，至終濃度0.05%。將擬南芥花序倒浸在菌液中約1 min。然后用塑料膜覆蓋以保持濕度，暗處過夜。第2天放回培養室內正常條件下培養直到成熟，將收獲的T1擬南芥種子用于篩選轉基因植株[13-14]。

1.2.3 轉基因擬南芥的篩選和鑒定轉基因T1種子用70%乙醇消毒5 min；用無菌水洗滌3～5次后，均勻涂播于含有50 mg/L潮霉素的1/2 MS固體培養基上；4℃春化3天，移入培養室。14 d后將平板上存活的幼苗轉入土中，覆膜保濕7 d。

采用蔗糖法[15]提取擬南芥基因組DNA，略做改動。即收集生長14 d左右的擬南芥幼葉樣品于冰置的100 μL的蔗糖溶液（50 mmol/L Tris-HCl，pH值7.5，300 mmol/L NaCl，300 mmol/L蔗糖）中，用槍頭將葉片壓碎，在PCR儀上99℃加熱10 min，然后6 000 r/min瞬時離心，用1 μL的上清進行PCR反應。鑒定純合的myb26 T-DNA突變體所用引物為：T-DNA左邊界引物LBb3和MYB26基因座位特異引物MYB26-RP和MYB26-LP；鑒定35S：MS606轉基因植株所用引物為MS606-Fv和GFP-pGWB5-R。引物序列列于表1。

1.2.4 RT-PCR檢測轉基因植物中MS606和MYB26的表達取經基因型分析篩選出的純合轉基因植株花蕾，利用TaKaRa的RNAisoPlus試劑提取總RNA。用NanoDrop 2 000超微量分光光度計測定RNA的濃度。利用PrimeScriptTMII RT試劑盒對2 μg的RNA合成cDNA。然后，利用MS606基因的特異引物MS606-F和MS606-R及MYB26基因的特異引物MYB26-F和MYB26-R，進行RT-PCR檢測MS606和MYB26的表達，ACTIN2基因作為內參。引物序列列于表1。擴增條件：94℃3 min；94℃3 min，58℃30 s，72℃1 min，25個循環；最后72℃延伸5 min。擴增產物采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 引物序列

1.2.5 轉基因植株35S：MS606/myb26的表型分析

植物轉入生殖生長后，觀察35S：MS606/myb26轉基因植株的角果是否能夠正常伸長，產生種子。同時種植野生型和myb26突變體作為對照。

2 結果與分析

2.1 35S∶MS606/myb26轉基因植株的鑒定

利用農桿菌介導的花苞浸染法，將pGWB5-MS606轉化擬南芥myb26/MYB26雜合體。收獲的種子在含有50 mg/L潮霉素的1/2 MS培養基上進行抗性篩選，得到轉化植株40株?？剐灾仓贽D入土中繼續培養。采用蔗糖提取法提取這些抗性植株的基因組DNA，進行分析鑒定。

首先，利用“三引物法”鑒定純合的T-DNA插入突變體。SALK_112372株系，T-DNA插入位于MYB26轉錄物的第3外顯子上。利用T-DNA插入兩端MYB26基因特異的引物MYB26-LP和MYB26-RP，對篩選出的植株進行PCR鑒定。MYB26-LP和MYB26-RP只能在野生型或雜合體中擴增出產物；在T-DNA插入純合體中，由于T-DNA本身的長度約為17 kb，過長的模板會阻抑目的基因特異擴增產物的形成。PCR鑒定結果顯示，有8個單株沒有MYB26特異的PCR產物，表明這些株系有T-DNA插入（圖1-A，C箭頭所示）；利用T-DNA左邊界引物LBb3和MYB26基因座位特異引物MYB26-RP對這些株系進行擴增，結果顯示，這8個單株有T-DNA插入的特異性擴增條帶（圖1-B，D箭頭所示）。根據圖1的PCR結果可以確定，這8個單株為純合T-DNA插入突變體myb26。

然后，利用重組質粒pGWB5-MS606特異性的引物2g23470-1230-F和GFP-pGWB5-R，對這8株具有純合T-DNA插入的myb26突變體進行PCR鑒定，轉基因植株檢測到900 bp的目標條帶（圖2），說明pGWB5-MS606已經被整合到擬南芥基因組中，所獲得的抗性植株為轉化株。

2.2 轉基因植株中MS606和MYB26的表達分析

對篩選到的35S：MS606/myb26轉基因植株，采用半定量RT-PCR，分別利用MS606和MYB26特異的引物進行基因表達分析，結果顯示，轉基因植株中MYB26的表達顯著降低（圖3-A），說明所轉化的植物的背景的確是MYB26敲除的純合突變體；而MS606基因的表達水平得到了提高（圖3-B），表明MS606基因在myb26突變體中得到了過表達。

2.3 35S：MS606/myb26轉基因植株的表型分析

對35S：MS606/myb26轉基因植株、野生型和myb26突變體的表型進行觀察，結果發現，與野生型相比，35S：MS606/myb26轉基因植株角果短小而雄性不育；與myb26相比，35S：MS606/myb26轉基因植株的角果發育沒有明顯的變化（圖4），MS606基因不能恢復myb26雄性不育的表型。

3 討論

DUF647蛋白家族是在真核生物中廣泛存在的、高度保守的蛋白家族，在擬南芥、水稻和苔蘚植物中都有同源基因。擬南芥中有6個DUF647蛋白家族成員[16]。最近的研究表明，RUS1和RUS2在擬南芥幼苗形態發生和生長素極性運輸中發揮著重要作用[17-20]。MS606屬于DUF647蛋白家族的一個成員；ms606突變體雄性不育，其藥室內壁次生加厚發生異常，花藥不能開裂。

轉錄因子MYB26是調控藥室內壁次生加厚相關基因表達和決定特定細胞次生加厚的一個關鍵因子[9]，在myb26突變體中，花藥的藥室內壁次生加厚和木質化異常。本試驗將過表達MS606的重組質粒通過農桿菌介導法轉入myb26×Col雜交產生的F1雜合體植株中，通過抗性篩選，獲得了T1轉化植株；通過對T2基于PCR的基因型分析，篩選得到了純合的35S：MS606/myb26轉基因植株。表達分析顯示，轉基因植株花蕾中MS606表達升高，MYB26表達明顯下調。對轉基因植株的表型觀察發現，過表達MS606對myb26突變體的表型沒有影響，雄性不育表型不能逆轉，推測MYB26和MS606基因可能通過不同的途徑發揮作用。盡管目前已經鑒定了藥室內壁次生加厚過程的一些重要的調控因子，但是對于其具體調控機制仍不是很清楚。純合35S：MS606/myb26轉基因植株的獲得，為進一步分析MS606和MYB26在調控花藥藥室內壁次生加厚中的作用提供了有價值的試驗材料。

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Identification of35S:MS606/myb26Transgenic Plants inArabidopsis thalianaL.

SONGXin，ZHAOShuqing
（Institute ofBiotechnology，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

ms606 is a male sterile mutant with defect in anther dehiscence.Anthers fromthe ms606 plants fail todehiscence due to loss ofendotheciumsecondarythickening.The transcription factor MYB26 plays a regulatoryrole in endothecium lignification.Therefore, the relationship between MS606 and MYB26 is deserved to investigate.The 35S：MS606 cDNA construct was introduced into the myb26 background to determine whether MS606 overexpression had any effect on myb26 mutant phenotype.The transgenic plants were selected by hygromycin resistance and confirmed by PCR genotyping.RT-PCR showed that MS606 was overexpressed in homozygous 35S：MS606/myb26 transgenic plants.This study has provided a basis for further investigating the relationship between MS606 and MYB26 on endotheciumsecondarythickeningin Arabidopsis.

Arabidopsis thaliana L.;transgene;MS606;MYB26;gene expression

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.05.02

Q943.2

：A

：1002-2481（2017）05-0680-04

2017-01-27

國家自然科學基金項目（31170273）；山西省回國留學人員科研資助項目（2015）

宋欣（1990-），女，山西潞城人，在讀碩士，研究方向：植物分子生物學。趙淑清為通信作者。