斑馬魚對水源水質的生物預警研究

李清雪，張寶中，車克鎧

斑馬魚對水源水質的生物預警研究

李清雪1，張寶中2，車克鎧3

（1.河北工程大學 學科規劃與建設處，河北 邯鄲 056038；2.河北工程大學 能源與環境工程學院，河北 邯鄲056038；3.滄州規劃設計研究院，河北 滄州 061000）

針對水源水質典型污染物（重金屬、有機物），以斑馬魚為試驗生物，研究目標污染物對斑馬魚的毒性效應，用SPSS軟件計算目標污染物對斑馬魚的半致死濃度，同時進行目標污染物對斑馬魚死亡率的Pearson相關系數檢驗。結果表明：重金屬和有機物對斑馬魚死亡率存在劑量-效應關系；斑馬魚能夠靈敏檢測水源污染，在污染物濃度極低時（Hg2+為8 μg/L、Cd2+為1.5 mg/L、氯苯為12 mg/L），斑馬魚仍然有響應，因此斑馬魚的毒性測試方法可以用來對水源污染進行生物預警。

水源安全；生物預警；斑馬魚；重金屬；有機物

近年來，我國水污染事件頻繁發生，嚴重威脅飲用水水源安全[1]。2005年以來，我國相繼發生了松花江硝基苯水污染、太湖藍藻暴發、山西汾河水庫水質污染、湘江鎘污染、湖北枝江化學原料污染等水源水質污染事件[2-3]。如何在事故發生的第一時間應用科學合理的預警監測技術實現預警至關重要，其有助于及時識別水質污染和水質異常[4]。目前研究的新型水質綜合毒性都是利用生物監測來完成的[5-8]。本文以岳城水庫為研究水域，以斑馬魚作為試驗生物，研究其對重金屬和有機污染物的響應，此實驗對及時發現岳城水庫當地人民的飲用水安全隱患，及后續污染防治具有重要的科學意義。

1 實驗材料和方法

1.1 試驗材料

供試斑馬魚購于邯鄲市某花鳥魚蟲市場，魚長（30±5） mm、重（0.3±0.1) g，在實驗室（22±1)oC直徑為30 cm的魚缸內馴養12 d。每天喂食并清理糞便和殘余餌料，實驗前24 h停止喂食，馴養期間未出現魚體死亡情況。

HgCl2、Pb(NO3)2、Cd(NO3)2、K2Cr2O7、As2O3、苯酚、二甲苯、甲苯、氯苯、苯均為分析純，購于天津市津東天正精細化學試劑廠。

本試驗用水取自岳城水庫，水質為Ⅱ水，偶爾會出現Ⅲ水，在用于實驗之前進行曝氣充氧使得溶解氧≧8.6 mg/L。

母液配制：重金屬以離子濃度為10 mg/L配置母液；對于有機物，依次移取所需試劑、一定量助溶劑無水乙醇和乳化劑吐溫-80于一小燒杯中混勻，用蒸餾水定容到所需刻度。其中助溶劑和乳化劑不超過0.2%。

1.2 試驗方法

首先進行預實驗，得到污染物對斑馬魚全致死濃度和全不致死濃度（表1），然后在此濃度范圍內按照幾何級數梯度設置5個濃度進行正式實驗，每個濃度重復3次，同時設空白對照組。實驗在直徑為30 cm的魚缸內進行，每個魚缸放入10尾魚，每12 h換一次水，以保證試液濃度和溶解氧含量，光暗比12：12（以小時計），溫度（22±1)oC，實驗周期為96 h，每12 h記錄斑馬魚死亡情況及其中毒癥狀，并及時撈出死魚。

表1 實驗溶液濃度設定Tab.1 Concentration of test solution

1.3 數據處理

數據采用SPSS13.0計算污染物對斑馬魚半致死濃度LC50、Pearson相關系數和95%置信區間。

2 結果分析

2.1 重金屬對斑馬魚的毒性效應

斑馬魚的死亡率隨不同重金屬濃度的發展如圖1～圖5。

圖1 Hg2+對斑馬魚死亡率影響Fig.1 Effect of Hg2+on zebrafish mortality

圖2 Pb2+對斑馬魚死亡率影響Fig.2 Effect of Pb2+on zebrafish mortality

圖3 Cd2+對斑馬魚死亡率影響Fig.3 Effect of Cd2+on zebrafish mortality

圖4 Cr6+對斑馬魚死亡率影響Fig.4 Effect of Cr6+on zebrafish mortality

圖5 As3+對斑馬魚死亡率影響Fig.5 Effect of As3+on zebrafish mortality

在重金屬對斑馬魚的毒性效應試驗中，空白組均未出現魚的異常反應。當Hg2+、Pb2+、Cd2+、Cr6+、As3+濃度分別超過引起斑馬魚死亡的初始濃度20 μg/L、2 mg/L、2 mg/L、24 mg/L、15 mg/L時，隨著重金屬離子濃度的增加，斑馬魚死亡率逐漸升高；當其濃度分別達65 μg/L、9.5 mg/L、6.5 mg/L、50 mg/L、80 mg/L時，斑馬魚全部死亡。通過實驗觀察：斑馬魚對重金屬中毒初期，均表現出劇烈、無序游動，身體失衡，同時伴有抽搐現象，中毒癥狀嚴重程度與濃度大小基本成正比。對各種重金屬濃度和斑馬魚死亡率進行劑量-效應相關性分析，得到Pearson相關系數R。數據結果分析得到96 h半致死濃度LC50，以及95%置信區間（表2）。

實驗結果表明：所關注的五種重金屬離子，Cr6+、Cd2+、Hg2+、Pb2+、As3+對斑馬魚的LC50見表2，毒性大小依次為Hg2+＞Pb2+＞Cd2+＞As3+＞Cr6+。根據魚類毒性分級標準[8]，Hg2+為極高毒，Pb2+、Cd2+為高毒，Cr6+、As3+為中毒。各種金屬離子濃度與斑馬魚死亡率存在劑量-效應關系。

2.2 有機物對斑馬魚的毒性效應

在有機物對斑馬魚的毒性效應實驗中，對照組沒有出現異常癥狀。當苯酚、甲苯、二甲苯、氯苯、苯濃度分別到達45、85、40、27、160 mg/L時，斑馬魚開始出現死亡現象，隨著有機物濃度的增加死亡率升高（圖6～圖10）。當各有機物濃度分別達到115、178、123、75、340 mg/L時，斑馬魚全部死亡。通過實驗觀察：斑馬魚受有機污染物影響均表現出興奮并快速游動，開始豎游、側游、偶爾出現掙扎性竄動，且伴有麻醉現象。

對各有機物濃度與斑馬魚死亡率進行劑量-效應相關性分析得到Pearson相關系數R。數據結果分析得到96 h半致死濃度LC50以及95%置信區間（表3）。實驗結果表明：五種有機污染物中，苯酚、甲苯、二甲苯、氯苯、苯對斑馬魚的LC50見表3，毒性大小依次為：氯苯＞苯酚＞二甲苯＞甲苯＞苯。根據魚類毒性分級標準[9]，其中苯酚、甲苯、二甲苯、氯苯為中毒，苯為低毒，各種有機污染物對斑馬魚死亡率存在劑量-效應關系。

表2 各金屬離子對斑馬魚96 h半致死濃度LC50、95%置信區間及相關系數Tab.2 Metal ion 96 h-LC50, 95% conf i dence interval and Pearson correlation coeff i cient

表3 各有機物對斑馬魚96 h半致死濃度LC50、95 %置信區間及相關系數Tab.3 Organic of 96 h-LC50,95% conf i dence interval and Pearson correlation coeff i cient

圖6 苯酚對斑馬魚死亡率影響Fig.6 Effect of phenolon zebrafish mortality

圖7 甲苯對斑馬魚死亡率影響Fig.7 Effect of toluene on zebrafish mortality

圖8 二甲苯對斑馬魚死亡率影響Fig.8 Effect of xylene on zebrafish mortality

圖9 氯苯對斑馬魚死亡率影響Fig.9 Effect of chlorobenzene on zebrafish mortality

圖10 苯對斑馬魚死亡率影響Fig.10 .Effect of benzene on zebrafish mortality

3 結論

1）通過對比重金屬離子對斑馬魚96 h半致死濃度LC50，金屬離子毒性大小為：Hg2+＞Pb2+＞Cd2+＞As3+＞Cr6+。根據魚類毒性分級標準，其中Hg2+為極高毒，Pb2+、Cd2+為高毒，Cr6+、As3+為中毒。各種金屬離子對斑馬魚死亡率存在劑量效應關系。

2）根據對比有機污染物對斑馬魚96 h半致死濃度LC50，有機污染物毒性大小為：氯苯＞苯酚＞二甲苯＞甲苯＞苯。根據魚類毒性分級標準，其中苯酚、甲苯、二甲苯、氯苯為中毒，苯為低毒。各種有機污染物對斑馬魚死亡率存在劑量-效應關系。

3）用重金屬離子與有機污染物對斑馬魚的死亡狀況加以對比。重金屬離子對斑馬魚致死程度比較高，有機污染物對斑馬魚的有較強的麻醉作用。

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（責任編輯 王利君）

Biological early warning for water quality on zebrafish

LI Qingxue1,ZHANG Baozhong2,CHE Kekai3

(1.Department of Disciplines Plan and Construction, Hebei University of Engineering, Hebei Handan, 056038, China；2.College of Urban Construction, Hebei University of Engineering, Hebei Handan, 056038, China；3.Institute of Plan and Design, Traffic South Street, Xinhua District, Hebei Cangzhou, 061000, China)

The early warning of water source pollution with biological monitoring method is studied. The zebrafish is used as the experimental object. And the SPSS according to behavioral difference of fish in different toxicity environment. The study shows that the dose effect relationship was exists between heavy metals, organic compounds and zebrafish mortality. As a result, toxicity testing methods on zebrafish can be used to carry on biological pre-alarm for water pollution.

Water security; biological monitoring; zebrafish; heavy metal; organic compound

X832

A

1673-9469（2017）01-0061-05

10.3969/j.issn.1673-9469.2017.01.014

投稿日期：2016-09-12 特約專稿

水利部公益性行業科研專項（201401030）

李清雪（1964-），女，河北大名人，博士，教授，從事水處理方面研究。