均勻設計法優化附子中多糖的超聲提取工藝Δ

魯 靜，牛曉靜（河南中醫藥大學第一附屬醫院藥學部，鄭州 450000）

均勻設計法優化附子中多糖的超聲提取工藝Δ

魯 靜＊，牛曉靜（河南中醫藥大學第一附屬醫院藥學部，鄭州 450000）

目的：優化超聲法提取附子中多糖的工藝。方法：采用均勻設計法，考察液料比、超聲時間、超聲溫度對附子多糖提取率的影響，進行驗證試驗并與常規煎煮法結果比較。結果：優化的超聲提取工藝為液料比10m L/g、超聲時間34min、超聲溫度73℃；驗證試驗中多糖提取率為19.05%（RSD＝0.60%，n＝3），與預測值（19.44%）的相對誤差為2.0%，提取率高于煎煮法的16.42%。結論：優化的超聲提取工藝簡單、快速、穩定，且提取率較高，適用于附子中多糖的提取。

附子；多糖；超聲提取；工藝優化；均勻設計法

附子是毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaelii Debx.）的子根，味辛甘，性熱，有毒，歸心、腎、脾經，具有回陽救逆、散寒除濕的功效，主治陰盛格陽、大汗亡陽、吐瀉厥逆、心腹冷痛等[1]。由于附子毒性較大，臨床上常以其炮制品入藥，根據加工方式的不同，可分為鹽附子、黑順片、白附片、淡附片等，其中黑順片的臨床使用頻率較高[2]。目前，對附子成分的研究多集中在生物堿[3]，而關于附子多糖的報道相對較少。附子多糖作為附子有效成分之一，已證實的生物活性涉及免疫調節、抗腫瘤、保護心肌、降血糖等多個方面[4-7]，具有一定的研究價值。

附子多糖的提取方法主要有煎煮法、熱水浸提法、微波提取法等[8-10]。煎煮法和熱水浸提法所需時間較長，而微波提取設備不易普及。超聲提取法具有操作簡單、提取時間短、提取率高、對成分影響小等優點，被廣泛用于中藥有效成分的提取[11-12]。為了更加有效地提取附子多糖，本試驗采用均勻設計法對附子超聲提取工藝進行優化，為附子多糖的有效利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

TU-1901型雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；KQ-100DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA224S-CW型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；LXJ-IIB型離心機（上海安亭科學儀器廠）；FW-500型高速萬能粉碎機（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

D-無水葡萄糖（以下簡稱葡萄糖）對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-200503，含量：以99.5%計）；蒽酮、無水乙醇、濃硫酸等均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 藥材

黑順片（產地：四川，批號：151203）由河南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房提供，經河南中醫藥大學第一附屬醫院藥學部陳天朝主任藥師鑒定為毛茛科植物烏頭的子根。

2 方法與結果

2.1 多糖的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒質量的葡萄糖對照品10.80mg，用水溶解并定容至100m L量瓶中，搖勻，制成質量濃度為108.0μg/m L的葡萄糖對照品溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取黑順片粉末10 g，精密稱定，加入80%乙醇適量過夜，回流提取3 h脫脂，藥渣揮干后，加入一定體積的水，按照設定的超聲條件提取；過濾，濾液濃縮至適量，加入4倍量無水乙醇，搖勻，4℃放置24 h，離心（4 000 r/m in，20m in，離心半徑為20 cm）；棄去上清液，沉淀用水溶解，轉移并定容至1 000m L量瓶中，搖勻，再精密移取8m L，用水稀釋并定容至250 m L量瓶中，搖勻，即得。

2.1.3 標準曲線的繪制 精密吸取葡萄糖對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4m L，置于10m L具塞刻度試管中，加水至2m L，搖勻；迅速精密加入0.1%蒽酮-硫酸溶液6m L，混勻后于沸水浴中加熱15min，取出，立即置于冰水浴中冷卻15min，取出。以相應的試劑為空白，在625 nm波長處測定吸光度（A）。以A為縱坐標、葡萄糖質量濃度（c）為橫坐標，繪制標準曲線，得到方程為：A＝43.363c+0.036 44（R2＝0.999 4）。結果表明葡萄糖檢測質量濃度線性范圍為2.7～18.9μg/m L。

2.1.4 精密度、穩定性和準確度試驗 按相關方法進行操作。結果精密度試驗中吸光度的RSD為0.41%（n＝6）；穩定性試驗中供試品溶液在放置90m in內吸光度的RSD為0.78%（n＝6）；準確度試驗中平均加樣回收率為99.4%（RSD＝2.06%，n＝9）。

2.1.5 樣品含量測定 精密量取供試品溶液2m L，置于10m L具塞刻度試管，搖勻，迅速精密加入新制備的0.1%蒽酮-硫酸溶液6m L，其余操作同“2.1.3”項。根據標準曲線方程計算供試品溶液中多糖含量。

2.2 均勻試驗設計

在預試驗基礎上，選擇液料比（X1）、超聲時間（X2）、超聲溫度（X3）為考察因素，以附子多糖提取率（Y，多糖提取率＝供試品溶液中多糖質量濃度×供試品溶液總體積/藥材質量×100%）為評價指標，每個因素設置8個水平，選用均勻設計表U8*（83）設計試驗方案。稱取黑順片粉末8份，每份約10 g，按“2.1.2”項下方法處理，測定樣品中多糖含量，每組試驗重復3次。均勻試驗的因素與水平見表1，試驗設計與結果見表2。

表1 因素與水平Tab 1 Factorsand levels

表2 均勻試驗設計與結果Tab 2 Design and resultsof uniform test

利用SPSS 22.0對試驗數據進行二次多項式回歸分析處理，得到Y與X1、X2、X3的回歸方程為：Y＝5.030 9－0.235 9X2+0.004 5X1X2－0.002 1X1X3+0.003 3X2X3+0.002 7X32（R＝0.992）。調整后R2＝0.946，P＝0.038＜0.05，表明回歸方程擬合度高，且具有統計學意義。各因素對Y的影響大小為：X32（P＝0.030）＞X1X2（P＝0.079）＞X1X3（P＝0.114）＞X2X3（P＝0.159）＞X2（P＝0.165）。X1與X2、X1與X3、X2與X3存在交互作用：X2、X1X3的系數為負值，提示其與Y呈負相關；X1X2、X2X3、X32的系數為正值，提示其與Y呈正相關。

將回歸方程進行規劃求解，Y值大者為佳，得到附子多糖最優提取條件為液料比10m L/g、超聲時間34m in，超聲溫度73℃，此時Y預測值為19.44%。

2.3 工藝驗證

取黑順片粉末50 g，精密稱定，共3份，按上述最優提取工藝條件進行驗證試驗。得多糖提取率分別為18.92%、19.08%、19.14%，平均值為19.05%（RSD＝0.60%，n＝3），與預測值接近，相對誤差為2.0%，提示回歸方程預測基本準確，優化后的試驗條件可靠，結果重現性好。

2.4 與煎煮法比較

煎煮法方法參考文獻[8]。取黑順片粉末50 g，精密稱定，脫脂后加入10倍量的水，煎煮2次，每次2 h；過濾，合并濾液，濃縮至適量，其余按“2.1.2”項下自“加入4倍量體積無水乙醇”起操作，按“2.1.5”項下方法測定，測得多糖提取率為16.42%（n＝3）。結果表明，超聲法提取附子多糖的提取率要高于煎煮法。

3 討論

超聲法是近年來應用于中藥有效成分提取分離的較為成熟的技術，主要通過超聲波的空化效應、機械效應、熱效應等[13]促進中藥有效成分進入溶劑。該方法具有簡便、快速、高效、節能等特點。目前，國內外利用超聲法提取中藥有效成分的報道屢見不鮮，涉及絕大部分中藥的多個種類的活性成分，提取方法已收錄至多版《中國藥典》中，用于制備樣品以進行目標成分的鑒定或含量測定。隨著科學技術的不斷進步和對超聲提取工業化設備的探索研究，循環超聲提取機、超聲逆流循環提取機已研發成功并適用于揮發性或非揮發性溶劑提取有效成分。中試型超聲提取機提取葛根素的研究已見報道，單次可提取葛根0.5 kg[14]。超聲波強化逆流提取機的開發，滿足了藥材提取物生產的工藝要求，產品品質和生產效益得到大幅度提高，有望應用于工業化生產[15]。因此，超聲法在中藥領域具有廣闊的應用前景和開發價值。附子多糖的提取目前多采用煎煮或熱水浸提，提取時間長（約4 h）。而本試驗建立的附子多糖的超聲提取法，方法操作簡單，不僅提取時間較傳統方法縮短80%（34min vs.4 h）以上，且提取率較高。

當試驗所研究的因素和水平數較多時，均勻試驗設計比其他設計法需要更少的試驗次數，且能夠反映因素之間的交互作用，具有明顯的優越性。設計時要求試驗點在整個區域內分布均勻，水平范圍應盡可能選擇更大，得到的結果才具有較好的代表性；若試驗范圍太小，不容易獲得比已有條件有顯著改善的結果。本試驗采用均勻設計對超聲提取附子多糖的工藝條件進行優化，文獻中提取植物多糖的液料比多在5～100m L/g[16-17]，筆者考慮到液料比較小時多糖提取可能不完全，過大時超聲波輻射又會被溶劑大量吸收，不但可影響多糖提取率，且易造成浪費，故結合預試驗結果，確定液料比為10～80m L/g。對提取溫度的選擇，依據均勻設計法的要求，設定相對較大的水平范圍為10～80℃。結果表明，液料比、超聲時間、超聲時間3個因素存在交互作用；最優提取條件下，附子多糖的提取率與預測值相符。故本文建立的提取方法準確、可靠，為附子多糖的深入研究和開發利用提供了科學的研究基礎。

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Optim ization of Ultrasonic Extraction Technology for Polysaccharide from Aconiti Lateralis Radix Praeparata by Uniform Design M ethod

LU Jing，NIU Xiaojing（Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Henan University of TCM，Zhengzhou 450000，China）

OBJECTIVE：To optim ize ultrasonic extraction technology for polysaccharide from Aconiti lateralis radix praeparata（ALRP）.METHODS：Uniform design method was applied to investigate the effects of liquid material ratio，ultrasonic time and ultrasonic temperature on extraction rate of polysaccharide from ALRP.Verification test was conducted and compared w ith the results of conventional decoction and boiling method.RESULTS：Optim ized ultrasonic extraction technology was as follow as liquid material ratio of 10m L/g，ultrasonic time of 34min and ultrasonic temperature of 73℃.The polysaccharide extraction rate in verification test was 19.05%（RSD＝0.60%，n＝3），relative error of the predicted value（19.44%）was 2.0%，while the extraction rate was higher than decoction and boiling method（16.42%）.CONCLUSIONS：Optimized ultrasonic extraction technology is simple，rapid and stable w ith high extraction rate，which is suitable for extracting polysaccharide from ALRP.

Aconiti lateralis radix praeparata；Polysaccharide；Ultrasonic extraction；Technology optim ization；Uniform design method

R284.2

A

1001-0408（2017）13-1834-03

2016-08-22

2016-09-24）

（編輯：劉 萍）

河南中醫學院第一附屬醫院科研基金項目（No.2012KJ31）

＊主管藥師，博士。研究方向：藥物分析。電話：0371-66251204。E-mail：lujing1@msn.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.30