小柴胡湯對(duì)伊立替康致遲發(fā)性腹瀉模型小鼠血便的防治作用Δ

周 圓，楊光義，宛 蕾（1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，貴陽 55005；.十堰市太和醫(yī)院武當(dāng)中醫(yī)藥研究所，湖北十堰 44000）

小柴胡湯對(duì)伊立替康致遲發(fā)性腹瀉模型小鼠血便的防治作用Δ

周 圓1＊，楊光義2，宛 蕾1#（1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，貴陽 550025；2.十堰市太和醫(yī)院武當(dāng)中醫(yī)藥研究所，湖北十堰 442000）

目的：考察小柴胡湯對(duì)伊立替康（CPT-11）致遲發(fā)性腹瀉模型小鼠血便的防治作用。方法：將40只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（等體積生理鹽水）、模型對(duì)照組（等體積生理鹽水）、小柴胡湯組（1 500mg/kg，以生藥計(jì)）和洛哌丁胺組（陽性對(duì)照，0.533 3 mg/kg），ig給藥，每天1次，連續(xù)17 d。于實(shí)驗(yàn)第4～10天，除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠均ip CPT-11誘導(dǎo)遲發(fā)性腹瀉。測(cè)定小鼠體質(zhì)量變化、血便率并觀察小鼠大腸、小腸黏膜組織病理改變。結(jié)果：給藥17 d后，造模組小鼠的體質(zhì)量較正常對(duì)照組均明顯下降（P＜0.05），但小柴胡湯組小鼠體質(zhì)量高于模型對(duì)照組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)第11～17天，小柴胡湯組和洛哌丁胺組小鼠血便率均顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.01），且小柴胡湯組小鼠血便率低于洛哌丁胺組（P＜0.05）。病理觀察結(jié)果顯示，模型對(duì)照組小鼠大腸和小腸黏膜上皮細(xì)胞伴明顯彌漫性壞死脫落和炎癥細(xì)胞浸潤，給藥組小鼠腸黏膜組織均趨于正常。結(jié)論：小柴胡湯能有效降低血便率、改善腸黏膜組織損傷，對(duì)CPT-11致小鼠血便具有防治作用，且效果優(yōu)于陽性藥物洛哌丁胺。

小柴胡湯；伊立替康；遲發(fā)性腹瀉；腸黏膜損傷；血便；小鼠

伊立替康（Irinotecan，CPT-11）為臨床大腸癌化療的一線藥物，劑量限制性毒性為遲發(fā)性腹瀉[1]。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，CPT-11導(dǎo)致的腹瀉發(fā)病率高達(dá)60%～80%，患者可出現(xiàn)腹痛、水樣便甚至血便等嚴(yán)重毒性癥狀，單藥iv后發(fā)生首次稀便的平均時(shí)間是給藥后第5天[2-4]。腹瀉是癌癥化療中最常見的、需要醫(yī)療干預(yù)的毒副作用之一，需高度重視。目前，對(duì)于化療引起的腹瀉的治療藥品以阿片肽受體阻斷劑為主，臨床常用的有洛哌丁胺、可待因、奧曲肽等，雖然用藥后能減緩腹瀉、提高患者化療的耐受性，但藥物本身的副作用較大。中藥有悠久的使用歷史，利用中藥或中藥復(fù)方調(diào)控CPT-11的體內(nèi)代謝，可為防治由其導(dǎo)致的腹瀉提供一條有效的解決途徑。

小柴胡湯是漢代張仲景《傷寒論》少陽病癥的主方，由柴胡、黃芩、人參、半夏、甘草、生姜、大棗7味藥材組成，以寒熱往來、口苦咽干、胸脅苦滿、舌苔薄白、弦脈為辨證要點(diǎn)，為和解少陽之代表方[5]。文獻(xiàn)表明，中藥及其復(fù)方治療CPT-11致遲發(fā)性腹瀉具有較好療效[6-7]；朱克奇[8]采用小柴胡湯加味治療腸易激綜合征腹瀉患者效果良好。本課題組前期研究表明，小柴胡湯能干預(yù)CPT-11及其代謝產(chǎn)物的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)過程，抑制其膽汁外排，從而降低其腸毒性（血痢）[9]。在本研究，筆者擬以CPT-11誘導(dǎo)小鼠發(fā)生遲發(fā)性腹瀉，以小鼠體質(zhì)量、血便率和腸道損傷程度為指標(biāo)，以洛哌丁胺膠囊為陽性藥物，初步探索小柴胡湯對(duì)CPT-11所致遲發(fā)性腹瀉模型小鼠血便及腸黏膜損傷的防治作用，為進(jìn)一步研究小柴胡湯降低CPT-11腸毒性機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

JJ200精密電子天平（美國雙杰兄弟集團(tuán)有限公司）；MOTICBA600-4數(shù)字切片掃描儀[麥克奧迪（廈門）電氣股份有限公司]。

1.2 藥品與試劑

注射用鹽酸CPT-11（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：16061715，規(guī)格：100mg/支）；小柴胡湯浸膏[自制，水煎后濃縮至2 g/m L（以生藥計(jì)），批號(hào)：20160426]；鹽酸洛哌丁胺膠囊（以下簡稱為洛哌丁胺，西安楊森制藥有限公司，批號(hào)：160215551，規(guī)格：2mg/粒）；右旋糖酐40葡萄糖注射液（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：T16031502-2，規(guī)格：500m L/瓶）；氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司，批號(hào)：1606213702，規(guī)格：250m L/瓶）；尿糞便隱血定性檢測(cè)試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：R21596-100T）；甲醛、乙醚為分析純。

1.3 動(dòng)物

健康C57BL6小鼠40只，♂，體質(zhì)量為25～30 g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK（鄂）2011-0031。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境溫度為（25±2）℃、濕度為（50± 5）%、明暗周期為12 h，飼喂高脂飼料3周后開始實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 分組、給藥與造模

將40只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、小柴胡湯組和洛哌丁胺組，每組10只。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組小鼠ig等體積生理鹽水；小柴胡湯組小鼠ig小柴胡湯（0.2m L/25 g），劑量為1 500mg/kg；洛哌丁胺組小鼠ig洛哌丁胺（0.2m L/25 g），劑量為0.533 3mg/kg，每天1次，連續(xù)17 d。于實(shí)驗(yàn)第4～10天，正常對(duì)照組小鼠在給藥同時(shí)每天1次ip右旋糖酐40葡萄糖注射液；其余各組小鼠均每天1次ip CPT-11，劑量為50mg/kg，以誘導(dǎo)遲發(fā)性腹瀉的發(fā)生。

2.2 取材與指標(biāo)測(cè)定

每天測(cè)量小鼠體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)第4～17天按照試劑盒說明書操作檢測(cè)小鼠是否血便，并計(jì)算血便發(fā)生率。給藥結(jié)束后，所有小鼠乙醚麻醉處死，取大腸、小腸組織，用生理鹽水沖洗干凈，置于4%甲醛溶液固定，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋切片（厚度4μm）后，蘇木精-伊紅（HE）染色，用數(shù)字切片掃描儀在100倍物鏡下觀察小鼠大腸、小腸黏膜組織的病理改變。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 體質(zhì)量測(cè)定結(jié)果

各組小鼠實(shí)驗(yàn)第1、4、10、17天的體質(zhì)量測(cè)定結(jié)果見表1，17 d內(nèi)體質(zhì)量變化趨勢(shì)見圖1。

表1 實(shí)驗(yàn)第1、4、10、17天的小鼠體質(zhì)量測(cè)定結(jié)果（± s，n＝10，g）Tab 1 Determ ination results of body mass at 1st，4th，10th，17th day ofm ice（±s，n＝10，g）

表1 實(shí)驗(yàn)第1、4、10、17天的小鼠體質(zhì)量測(cè)定結(jié)果（± s，n＝10，g）Tab 1 Determ ination results of body mass at 1st，4th，10th，17th day ofm ice（±s，n＝10，g）

注：與正常對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，#P＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model control group，#P＜0.05

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組小柴胡湯組洛哌丁胺組第17天31.66±0.67 21.74±2.43＊24.40±1.66＊#22.51±2.65＊第1天29.00±0.44 29.21±0.38 29.30±1.97 29.12±1.76第4天29.48±0.47 29.00±0.50 30.03±1.85 28.30±1.67第10天30.85±0.60 25.12±1.35＊26.39±1.07＊25.48±1.60＊

圖1 17 d內(nèi)小鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)Fig 1 The variation tendency of body m ass of m ice w ithin 17 days

由表1可知，在實(shí)驗(yàn)第1、4天時(shí)，各組小鼠的體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示ig小柴胡湯和洛哌丁胺不會(huì)影響正常小鼠的體質(zhì)量；實(shí)驗(yàn)第10天時(shí)，各造模組小鼠的體質(zhì)量較正常對(duì)照組均顯著降低（P＜0.05），驗(yàn)證了遲發(fā)性腹瀉能顯著降低小鼠體質(zhì)量；實(shí)驗(yàn)第17天時(shí)，雖各造模組小鼠的體質(zhì)量較正常對(duì)照組小鼠仍顯著降低（P＜0.05），但小柴胡湯組小鼠的體質(zhì)量顯著高于模型對(duì)照組（P＜0.05），提示小柴胡湯能一定程度改善小鼠體質(zhì)量減失。

由圖1可知，在實(shí)驗(yàn)期間，正常對(duì)照組小鼠的體質(zhì)量逐漸上升；其余各組小鼠體質(zhì)量的變化趨勢(shì)相近，均在5 d后開始下降，8 d后急劇下降。這表明CPT-11所致遲發(fā)型腹瀉能快速降低小鼠體質(zhì)量，且用藥時(shí)間越長體質(zhì)量下降越明顯，這可能是由于CPT-11在體內(nèi)蓄積加大了腸毒性而引起的；但13 d后，體質(zhì)量下降程度減緩，這可能是因?yàn)橥Ｖ菇o予CPT-11后CPT-11開始外排；15 d后模型對(duì)照組和洛哌丁胺組小鼠體質(zhì)量無明顯變化，然而小柴胡湯組小鼠的體質(zhì)量卻明顯增加，這可能是由于小柴胡湯保護(hù)胃腸道，從而使小鼠體質(zhì)量正常增長。

3.2 血便率測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)第4～10天各組小鼠均未檢出血便；實(shí)驗(yàn)第11天時(shí)，模型對(duì)照組小鼠有60%小鼠首次出現(xiàn)血便，而小柴胡湯組和洛哌丁胺組小鼠均在實(shí)驗(yàn)第12天時(shí)首次出現(xiàn)血便，提示小柴胡湯和洛哌丁胺均可一定程度地延緩血便發(fā)生。小柴胡湯組和洛哌丁胺組小鼠實(shí)驗(yàn)第11～17天的血便率均顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.01），提示這兩種藥物均能有效降低血便率，改善小鼠胃腸道狀況；且實(shí)驗(yàn)第12～17天小柴胡湯組小鼠血便率較洛哌丁胺組明顯降低（P＜0.05），提示小柴胡湯治療血便效果比洛哌丁胺好。實(shí)驗(yàn)第11～17天各組小鼠血便率測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)第11～17天小鼠血便率測(cè)定結(jié)果（%%）Tab 2 Determ ination results of bloodystool rate in 11th-17th day ofm ice（%%）

3.3 病理觀察結(jié)果

3.3.1 大腸黏膜組織病理觀察結(jié)果 正常對(duì)照組小鼠大腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，杯狀細(xì)胞形態(tài)正常。模型對(duì)照組小鼠大腸杯狀細(xì)胞消失，上皮黏膜細(xì)胞伴明顯彌漫性壞死脫落和炎癥細(xì)胞浸潤。與正常對(duì)照組比較，小柴胡湯組和洛哌丁胺組小鼠大腸杯狀細(xì)胞受損、腸絨毛萎縮，但較模型對(duì)照組有較大改善。各組小鼠大腸黏膜組織病理觀察結(jié)果見圖2。

3.3.2 小腸黏膜組織病理觀察結(jié)果 正常對(duì)照組小鼠小腸絨毛完整。模型對(duì)照組小鼠小腸上皮黏膜細(xì)胞伴明顯彌漫性壞死脫落和炎癥細(xì)胞浸潤，小腸絨毛消失。小柴胡湯組和洛哌丁胺組小鼠小腸絨毛較完整，接近正常。各組小鼠小腸黏膜組織病理觀察結(jié)果見圖2。

4 討論

在造模方法優(yōu)選的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，筆者對(duì)CPT-11的給藥劑量、給藥天數(shù)以及飼料類型進(jìn)行了篩選。筆者分別以25、50、75、100mg/kg CPT-11的注射劑量給藥，結(jié)果在50mg/kg劑量下小鼠血便率為100%且死亡率為0，故選擇50mg/kg CPT-11為本研究的給藥劑量。接著，筆者又考察了連續(xù)ip CPT-11（50mg/kg）6、7、8、9 d后小鼠的血便率，結(jié)果連續(xù)ip 6 d后小鼠血便率為40%，連續(xù)ip 7、8、9 d后小鼠血便率均為100%，故在本研究中采用連續(xù)ip CPT-11（50mg/kg）7 d的方法進(jìn)行造模。此外，筆者還對(duì)比了飼喂普通飼料和高脂飼料對(duì)小鼠血便發(fā)生的影響，結(jié)果普通飼料組小鼠血便率為0，高脂飼料組小鼠血便率為100%，故在本研究中采用高脂飼料飼喂。造模成功后，筆者還考察了小柴胡湯ig劑量分別為500、1 000、1 500、2 000mg/kg的效果，結(jié)果1 500mg/kg給藥劑量下效果最佳，故在本研究中以1 500mg/kg劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖2 小鼠大腸、小腸黏膜組織病理觀察結(jié)果（HE，× 100）Fig 2 Pathological observation results ofmucosal tissue of large and small intestine ofm ice（HE，× 100）

洛哌丁胺治療慢性腹瀉的臨床使用劑量為4mg/75 kg，換算成小鼠劑量即為0.533 3mg/kg。本研究采用小柴胡湯在ip CPT-11前3天開始給藥，連續(xù)給藥17 d。結(jié)果顯示，小柴胡湯組小鼠血便率明顯低于模型對(duì)照組和洛哌丁胺組，且體質(zhì)量較模型對(duì)照組和洛哌丁胺組得到改善，提示預(yù)先ig小柴胡湯對(duì)CPT-11所致血便具有預(yù)防作用，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小柴胡湯對(duì)CPT-11所致血便的防治效果比洛哌丁胺更好。CPT-11主要通過影響腸道上皮細(xì)胞腺體細(xì)胞的分裂和破壞腸道的消化酶，誘導(dǎo)前列腺素和多種炎癥因子釋放，破壞腸腔中水和電解質(zhì)的吸收、外排平衡，從而導(dǎo)致腹瀉[10]。從CPT-11的體內(nèi)代謝過程可發(fā)現(xiàn)腸黏膜在血便的發(fā)生及預(yù)防上起重要作用。在本研究中，模型對(duì)照組小鼠大腸和小腸正常結(jié)構(gòu)消失，黏膜上皮細(xì)胞伴明顯彌漫性壞死脫落和炎癥細(xì)胞浸潤，小柴胡湯組和洛哌丁胺組大腸、小腸基本正常，提示預(yù)先ig小柴胡湯和洛哌丁胺均能維持腸道結(jié)構(gòu)基本形態(tài)和功能，從而預(yù)防血便的發(fā)生。

綜上所述，小柴胡湯能有效降低血便率、改善腸組織損傷，對(duì)CPT-11所致血便具有防治作用，且效果較洛哌丁胺好，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步深入研究小柴胡湯抑制CPT-11腸毒性的機(jī)制奠定了一定基礎(chǔ)。

[1] 方青芳.化療相關(guān)性腹瀉的發(fā)生機(jī)制和治療策略[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2009，14（3）：351-355.

[2] Gibson RJ，Keefe DM.Cancer chemotherapy-induced diarrhoea and constipation：mechanisms of damage and prevention strategies[J].Support Care Cancer，2006，14（9）：890-900.

[3] 許麗娟，楊維維，許麗艷.伊立替康聯(lián)合治療轉(zhuǎn)移性大腸癌致遲發(fā)性腹瀉的護(hù)理體會(huì)[J].中外醫(yī)療，2011，30（24）：154.

[4] 孫祎，于振濤，胡曉文，等.伊立替康不良反應(yīng)及其臨床干預(yù)進(jìn)展[J].中國藥房，2007，18（35）：2781-2783.

[5] 萬文蓉.張仲景小柴胡湯臨床運(yùn)用發(fā)微[J].中華中醫(yī)藥雜志，2013，28（1）：124-127.

[6] Lam W，Bussom S，Guan F，etal.The four-herb Chinese medicine PHY906 reduces chemotherapy-induced gastrointestinal toxicity[J].SciTranslMed，2010，2（45）：45-59.

[7] Li C，Zhang L，Zhou L，et al.Comparison of intestinal absorption and disposition of structurally sim ilar bioactive flavones in radix scutellariae[J].AAPS J，2012，14（1）：23-34.

[8] 朱可奇.小柴胡湯加味治腸易激綜合征56例療效觀察[J].江西中醫(yī)藥，2000，31（5）：24-25.

[9] Basu S，Zeng M，Yin T，etal.Developmentand validation of an UPLC-MS/MSmethod for the quantification of Irinotecan，SN-38 and SN-38 glucuronide in plasma，urine，feces，liver and kidney：application to a pharmacokinetic study of irinotecan in rats[J].JChromatogr BAnalyt Technol Biomed Life Sci，2016，doi：10.1016/j.jchromb.2016. 02.012.

[10] Kornblau S，Benson AB，Catalano R，et al.Management of cancer treatment-related diarrhea：issues and therapeutic strategies[J].J Pain Symptom Manage，2000，19（2）：118-129.

Preventive and Treatment Effects of Xiaochaihu Decoction on Irinotecan-induced Bloodystool in M odel M ice w ith Delayed Diarrhea

ZHOU Yuan1，YANG Guangyi2，WAN Lei1（1.Pharmacology Teaching and Research Office，Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China；2.Institute of Wudang Herbal Medicine Research，Shiyan Taihe Hospital，Hubei Shiyan 442000，China）

Xiaochaihu decoction；Irinotecan；Delayed diarrhea；Intestinalmucosa injury；Bloodystool；M ice

R965.1

A

1001-0408（2017）13-1762-04

2016-11-14

2017-03-08）

（編輯：林 靜）

湖北省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)2017－2018年度科研立項(xiàng)項(xiàng)目（No.WJ2017F079）

＊藥師，碩士研究生。研究方向：藥理學(xué)。電話：0719-8801106。E-mail：89680313@qq.com

#通信作者：教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：藥理學(xué)。電話：0719-8801106。E-mail：1325164635@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.10

ABSTRACTOBJECTIVE：To investigate the prevention and treatment effect of Xiaochaihu decoction on irinotecan（CPT-11）-induced bloodystool in model m ice w ith delayed diarrhea.METHODS：40 m ice were random ly divided into normal control group（equal volume of normal saline），model control group（equal volume of normal saline），Xiaochaihu decoction group（1 500mg/kg，calculated by crude drug）and loperam ide group（positive control，0.533 3 mg/kg），ig，once a day，for 17 days.Except for normal control group，other groups were intraperitoneally injected CPT-11 to induce delayed diarrhea in 4th-10th day.Body mass changes，bloodystool rate of mice were determined，and pathological changes in large intestine and small intestine were observed.RESULTS：A fter 17 days of adm inistration，compared w ith normal control group，the body mass in modeling groups was obviously declined（P＜0.05），while body mass in Xiaochaihu decoction group was higher than model control group（P＜0.05）.In the 11th-17th day，bloodystool rate in Xiaochaihu decoction group and loperam ide group were significantly lower than model control group（P＜0.01），and bloodystool rate in Xiaochaihu decoction group was lower than loperamide group（P＜0.05）.Pathological results showed，obvious diffuse necrosis and inflammatory cell infiltration were observed in mucosal epithelial cells of large intestine and small intestine in model control group，and the intestinalmucosal tissue in adm inistration groups tended to be normal.CONCLUSIONS：Xiaochaihu decoction can effectively reduce bloodystool rate，improve intestinalmucosa injury，and has prevention and treatment effect on CPT-11-induced bloodystool inm ice，w ith superior effect to loperam ide.