缺氧條件下人卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥與TLR9的關(guān)系研究Δ

李 玲，李 斌，幸海燕，陳劍鴻（第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400042）

·實(shí)驗(yàn)研究·

缺氧條件下人卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥與TLR9的關(guān)系研究Δ

李 玲＊，李 斌，幸海燕，陳劍鴻#（第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400042）

目的：研究缺氧條件下人卵巢癌細(xì)胞（SKOV3）對(duì)順鉑耐藥與Toll樣受體9（TLR9）的關(guān)系。方法：采用免疫熒光法檢測(cè)破膜和未破膜SKOV3中TLR9的表達(dá)。取SKOV3，加入TLR9特異性激動(dòng)劑CpG-ODN 2006（A組）及其同型對(duì)照CpG-ODN 2006 control（B組）作用6、12、24 h后，加入順鉑，以CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞抑制率。取SKOV3或經(jīng)0（未加）、1、10、102、103μmol/LTLR9特異性拮抗劑氯喹預(yù)處理3 h后的SKOV3，加入SKOV3常氧（21%O2）、缺氧（1%O2）孵育6、12、24 h的細(xì)胞上清作用24 h后，加入順鉑，檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，計(jì)算預(yù)處理細(xì)胞缺氧時(shí)藥物抑制率的降低倍數(shù)（HICR）；并采用Western blot法檢測(cè)常氧24 h細(xì)胞上清（C組）、缺氧24 h細(xì)胞上清（D組）、缺氧24 h細(xì)胞上清+10μmol/L氯喹（E組）條件下SKOV3中多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）的表達(dá)。結(jié)果：TLR9在SKOV3的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)。與A組比較，B組細(xì)胞增殖抑制率降低（P＜0.01）。與常氧細(xì)胞上清比較，缺氧細(xì)胞上清作用后細(xì)胞增殖抑制率降低（P＜0.05）。與未加氯喹比較，加入10、102μmol/L氯喹能明顯降低HICR（P＜0.01），其中缺氧24 h細(xì)胞上清+10μmol/L氯喹降低最明顯。與C組比較，D組細(xì)胞中MRP表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.01）；與D組比較，E組細(xì)胞中MRP表達(dá)減弱（P＜0.01）。結(jié)論：TLR9受體在缺氧下可被激活，并可導(dǎo)致SKOV3對(duì)順鉑耐藥，該作用可能與上調(diào)MRP表達(dá)有關(guān)。

人卵巢細(xì)胞；缺氧；化療敏感性；Toll樣受體9；順鉑

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，目前除手術(shù)治療外，順鉑是治療卵巢癌的一線化療藥物。但卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥嚴(yán)重影響了其治療效果，因此，探索卵巢癌細(xì)胞耐藥相關(guān)因素及機(jī)制，尋找有效逆轉(zhuǎn)耐藥的治療靶點(diǎn)，對(duì)卵巢癌的治療具有重要意義。

Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）家族中的TLR9，是一種模式識(shí)別受體，可以識(shí)別微生物衍生的分子模式結(jié)構(gòu)（如：m tDNA），并引起受體的結(jié)構(gòu)性變化，然后通過銜接蛋白M yD88的募集反應(yīng)，促進(jìn)激酶類有絲分裂原激活蛋白的磷酸化，激活相應(yīng)信號(hào)通路，調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)。最初在肺癌和乳腺癌細(xì)胞系樣品中發(fā)現(xiàn)TLR9高表達(dá)與致癌作用相關(guān)。TLR9受到刺激后，可上調(diào)一些凋亡抑制基因，如Survivin、Bcl-xl等。另外，有研究證明，低氧可以導(dǎo)致實(shí)體瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性降低，這也可能是鉑類耐藥的重要因素[1]。為此，本研究在觀察卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥與TLR9受體的關(guān)系的同時(shí)，初步探究了二者在缺氧條件下的關(guān)系，以期為闡明卵巢癌細(xì)胞耐藥機(jī)制以及尋找新的化療增敏靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

低氧恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司）；全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；Ⅸ2-UCB激光共聚焦顯微鏡與CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

順鉑（批號(hào)：MKBV3446V，純度：≥99.9%）和氯喹（批號(hào)：085M 4098V，純度：≥98%）均購自美國Sigma公司；TLR9特異性激動(dòng)劑CpG-ODN 2006（批號(hào)：3710-61）及其同型對(duì)照CpG-ODN 2006 control（批號(hào)：3801-02T）購自美國InvivoGen公司；辣根過氧化物酶（HRP）山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗體、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton）（中國碧云天生物技術(shù)有限公司）；猴抗鼠熒光二抗、猴抗兔熒光二抗（美國Thermo公司）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美國Bio-Rad公司）；TLR9抗體、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）抗體（美國Abcam公司）；CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（上海東仁化學(xué)科技有限公司，批號(hào)：GA611）。

1.3 細(xì)胞

人卵巢癌細(xì)胞株（SKOV3）購自American Type Culture Collection（ATCC）公司，細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下的1640細(xì)胞培養(yǎng)基（高糖，含10%胎牛血清）中培養(yǎng)。

2 方法

2.1 細(xì)胞中TLR9的熒光表達(dá)

將SKOV3消化接種到爬片培養(yǎng)24 h后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，4%多聚甲醛固定，分為破膜組和未破膜組。破膜組細(xì)胞先根據(jù)蛋白定位情況加入Triton破膜20min，然后兩組細(xì)胞均用PBS洗3次，血清封閉1 h；加入TLR9抗體，4℃孵育過夜，PBS洗3次，每次5min；加入帶有熒光標(biāo)記的二抗暗處孵育1 h，PBS洗3次，每次5m in；加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核15 min，PBS洗3次，封片。激光共聚焦顯微鏡采集圖像，觀察2組SKOV3中TLR9的熒光表達(dá)。

2.2 細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥與TLR9的關(guān)系

將SKOV3（5×104m L－1）培養(yǎng)于96孔板，細(xì)胞貼壁后，分為A組（CpG-ODN 2006）和B組（CpG-ODN 2006 control），分別加入50μg/m L的CpG-ODN 2006或CpGODN 2006 control，作用6、12、24 h，棄培養(yǎng)基，加入3.5 μg/m L的順鉑培養(yǎng)24 h，再加入用培養(yǎng)基配制的10% CCK-8溶液，孵育3 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長處光密度（OD），計(jì)算增殖抑制率，增殖抑制率＝（空白孔OD值－給藥孔OD值）/（空白孔OD值－對(duì)照孔OD值）× 100%。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行3個(gè)復(fù)孔。

2.3 細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥與缺氧的關(guān)系

將SKOV3置于缺氧（1%O2）和常氧（21%O2）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6、12、24 h后，收集上清，離心去除細(xì)胞殘?jiān)眯迈r培養(yǎng)基稀釋制成缺氧細(xì)胞上清和常氧細(xì)胞上清。然后用含80%上述細(xì)胞上清的培養(yǎng)基培養(yǎng)SKOV3，每種細(xì)胞上清平行6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，按“2.1”項(xiàng)下方法加入順鉑后，測(cè)定OD值，計(jì)算增殖抑制率。

2.4 TLR9拮抗細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥與缺氧的關(guān)系

分別用0、1、10、102、103μmol/L的氯喹預(yù)處理SKOV3 3 h后，再用“2.3”項(xiàng)下含80%細(xì)胞上清（低氧、常氧下培養(yǎng)6、12、24 h）的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每種細(xì)胞上清平行6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，按“2.1”項(xiàng)下方法加入順鉑后，測(cè)定OD值，計(jì)算增殖抑制率。用“缺氧時(shí)藥物抑制率的降低倍數(shù)（HICR）”表示缺氧誘導(dǎo)的耐藥性，HICR＝（缺氧細(xì)胞上清的增殖抑制率－常氧細(xì)胞上清的增殖抑制率）/常氧細(xì)胞上清的增殖抑制率。

2.5 MRP表達(dá)與TLR9的關(guān)系

將SKOV3置于缺氧和常氧的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，制成80%的細(xì)胞上清。取SKOV3分為C組（常氧24 h細(xì)胞上清）、D組（缺氧24 h細(xì)胞上清）和E組（缺氧24 h細(xì)胞上清+10μmol/L氯喹），每組6個(gè)復(fù)孔，按相應(yīng)條件加入培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，采用Western blot法檢測(cè)TLR9、MRP蛋白表達(dá)。先提取細(xì)胞的總蛋白，測(cè)定蛋白濃度；待聚丙烯酰氨凝膠凝固后，電泳轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉1～2 h，加入對(duì)應(yīng)的TLR9抗體（1∶500稀釋）、MRP抗體（1∶500稀釋）、β-actin抗體（內(nèi)參，1∶1 000稀釋），4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜后加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜，曝光；Image Lab軟件分析圖片，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參比值評(píng)價(jià)目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞TLR9的熒光表達(dá)

結(jié)果表明，TLR9在SKOV3的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)。2組SKOV3中TLR9表達(dá)的熒光圖見圖1。

3.2 細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥與TLR9的關(guān)系

A組SKOV3在作用6、12、24 h后增殖抑制率分別為（47.97±0.49）%、（50.86±0.46）%、（53.09±0.70）%；B組分別為（51.19±0.90）%、（53.69±0.58）%、（55.13± 0.21）%（n＝6）。與B組比較，A組SKOV3對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的增殖抑制率明顯降低（P＜0.01）。

3.3 細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥與缺氧的關(guān)系

圖1 2組SKOV3中TLR9表達(dá)的熒光圖Fig 1 Fluorescence diagram of TLR9 expression in SKOV3 of 2 groups

常氧6、12、24 h細(xì)胞上清作用后SKOV3增殖抑制率分別為（52.89±5.11）%、（56.17±4.19）%、（53.16± 4.10）%；缺氧6、12、24 h細(xì)胞上清作用后SKOV3增殖抑制率分別為（48.77±4.76）%、（48.54±3.28）%、（45.49± 4.84）%（n＝6）。與常氧細(xì)胞上清比較，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的缺氧細(xì)胞上清作用后SKOV3增殖抑制率明顯降低（P＜0.05）。

3.4 TLR9拮抗細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥與缺氧的關(guān)系

與未加氯喹（0μmol/L）比較，加入10、102μmol/L氯喹能明顯降低HICR（P＜0.01），其中缺氧24 h細(xì)胞+10 μmol/L氯喹處理后HICR降低最明顯。不同濃度氯喹預(yù)處理不同時(shí)間后SKOV3的HICR測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 不同濃度氯喹預(yù)處理不同時(shí)間后SKOV3的HICR測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6，%%）Tab 1 Determ ination results of HICR of SKOV3 after pretreated by different concentrations of ch loroquine at different tim e（±s，n＝6，%%）

表1 不同濃度氯喹預(yù)處理不同時(shí)間后SKOV3的HICR測(cè)定結(jié)果（±s，n＝6，%%）Tab 1 Determ ination results of HICR of SKOV3 after pretreated by different concentrations of ch loroquine at different tim e（±s，n＝6，%%）

注：與未加氯喹（0μmol/L）比較，＊P＜0.01Note：vs.notadded chloroquine（0μmol/L），＊P＜0.01

24 h 5.17±0.42 5.03±0.71 1.86±0.30＊2.04±0.19＊5.94±0.34氯喹濃度，μmol/L 011 0 1021036 h 1.52±0.24 1.01±0.49 0.37±0.62＊1.05±0.73 1.02±0.44 12 h 3.92±0.80 4.68±0.70 1.46±0.44＊2.07±0.44＊4.03±0.77

3.5 MRP表達(dá)與TLR9的關(guān)系

與C組比較，D組細(xì)胞中MRP表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.01）；與D組比較，E組細(xì)胞中MRP表達(dá)減弱（P＜0.01）。3組SKOV3中MRP表達(dá)的電泳圖見圖2，測(cè)定結(jié)果見圖3。

4 討論

TLR9受體是一種先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞DNA受體，廣泛表達(dá)于各種人類癌細(xì)胞及癌組織中，包括乳腺癌、前列腺癌、胃癌、腎細(xì)胞癌、食管癌等[2-5]，其表達(dá)會(huì)影響腫瘤的免疫表型及化療，并在癌癥的預(yù)后中有重要作用。本研究選用了CpG-ODN 2006[6]和氯喹[7]分別作為TLR9的特異性激動(dòng)劑和拮抗劑。筆者以SKOV3為研究對(duì)象，通過免疫熒光染色直觀觀察發(fā)現(xiàn)TLR9在SKOV3的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，當(dāng)用CpG-ODN 2006刺激SKOV3后，細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性降低，不僅說明TLR9表達(dá)于SKOV3中，同時(shí)提示TLR9激活在腫瘤細(xì)胞的化療耐藥方面具有重要的功能。

圖2 3組SKOV3中MRP表達(dá)的電泳圖Fig 2 Electrophoresis chart of MRP expression in SKOV3 of3 groups

圖3 3組SKOV3中MRP表達(dá)的測(cè)定結(jié)果Fig 3 Determ ination results of MRP expression in SKOV3 of 3 groups

由于實(shí)體瘤細(xì)胞的惡性增殖速度大于血管生成速度，造成細(xì)胞缺氧，最近的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤缺氧微環(huán)境誘導(dǎo)的旁分泌因素是癌細(xì)胞耐藥的關(guān)鍵因素。在肝癌細(xì)胞中，缺氧會(huì)誘導(dǎo)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和一些損傷相關(guān)分子（DAMPS）釋放[8]，進(jìn)而降低細(xì)胞對(duì)環(huán)孢素和依托泊苷的敏感性[9]。因?yàn)镈AMPS中的核酸類物質(zhì)可以激活TLR9受體，于是本文設(shè)計(jì)了用缺氧不同時(shí)間的細(xì)胞上清刺激細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SKOV3對(duì)順鉑的敏感性降低，即缺氧細(xì)胞上清可以提高腫瘤細(xì)胞的耐藥性，說明缺氧后細(xì)胞會(huì)釋放某種物質(zhì)引起細(xì)胞耐藥。TLR9特異性拮抗劑氯喹能明顯抑制缺氧細(xì)胞上清對(duì)順鉑耐藥性的增強(qiáng)作用，提示卵巢癌細(xì)胞在受到類似缺氧的刺激下，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞受損，釋放一些損傷相關(guān)分子，從而活化TLR9受體。

缺氧細(xì)胞上清刺激SKOV3后，在提高順鉑耐藥性的同時(shí)上調(diào)了MRP蛋白的表達(dá)，而加入氯喹則削弱了這一效應(yīng)，提示缺氧細(xì)胞上清對(duì)耐藥蛋白的上調(diào)效應(yīng)與TLR9有關(guān)。TLR9被活化可激活NF-κB、MAPK等信號(hào)通路，調(diào)控MRP蛋白的表達(dá)[10-11]。已有研究發(fā)現(xiàn)異長春花堿可通過降低MRP1的表達(dá)逆轉(zhuǎn)人鼻咽癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥[12]。所以在卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥過程中，TLR9可能的作用機(jī)制是其活化導(dǎo)致了NF-κB、MAPK信號(hào)通路的激活，從而上調(diào)了MRP蛋白的表達(dá)，促使藥物外排增加，導(dǎo)致化療藥敏感性降低而出現(xiàn)耐藥。本研究從TLR9的角度為闡明卵巢癌的耐藥機(jī)制提供了新的依據(jù)，推測(cè)TLR9有望成為化療增敏的一個(gè)新靶點(diǎn)。

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Study on the Relationship between Cisp latin-resistance of Human Ovarian Cancer Cell and TLR9 under Hypoxia

LI Ling，LIBin，XING Haiyan，CHEN Jianhong（Dept.of Pharmacy，the Third Affiliated Hospital，Third M ilitary Medical University，Chongqing 400042，China）

OBJECTIVE：To study the relationship between cisplatin-resistant of human ovarian cancer cells（SKOV3）and Toll-like receptor 9（TLR9）under hypoxia.METHODS：Immunofluorescence method was used to detect the TLR9 expression in rupture and intactmembranes SKOV3.SKOV3 was taken，adding cisplatin，then CCK-8 was used to detect cell inhibition rate after 6，12，24 h of added into TLR9 specific agonists CpG-ODN 2006（group A）and its isotype control CpG-ODN 2006 control（group B）.SKOV3 or SKOV3 pretreated by 0（not added），1，10，102，103μmol/L TLR9 specific antagonist chloroquine for 3 h were taken，adding cisplatin，cell inhibition rate was detected after 24 h of added into SKOV3 normoxia（21%O2），hypoxia（1% O2）incubating 6，12，24 h，HICR under hypoxia in pretreatmentwas calculated.Western blotmethod was used to detect themultidrug resistance associated protein（MRP）expression in SKOV3 under the conditions of normoxia 24 h cell supernatant（group C），hypoxia 24 h cell supernatant（group D），hypoxia 24 h cell supernatant+10μmol/L chloroquine（group E）.RESULTS：TLR9 was expressed in both cellmembrane and cytoplasm of SKOV3.Compared w ith group A，cell inhibition rate in group B was decreased（P＜0.01）.Compared w ith normoxia cell supernatant，cell inhibition rate was decreased after hypoxia cell supernatant（P＜0.05）. Compared w ith not added chloroquine，adding 10，102μmol/L chloroquine can obviously decrease HICR（P＜0.01），and themost significant decrease was showed when using hypoxia 24 h cell supernatant+10μmol/L chloroquine.Compared w ith group C，MRP expression in group D was strengthened（P＜0.01）；compared w ith group D，MRP expression in group E was weakened（P＜0.01）.CONCLUSIONS：TLR9 receptors can be activated under hypoxia，and cause SKOV3 to cisplatin-resistance，the effectmay be related w ith up-regulating MRP expression.

Human ovarian cells；Hypoxia；Chemotherapy sensitivity；Toll-like receptor-9；Cisplatin

R361+.3

A

1001-0408（2017）13-1744-04

2017-01-13

2017-03-09）

（編輯：鄒麗娟）

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No.30973493）

＊碩士研究生。研究方向：腫瘤化療耐藥。電話：023-68812151。E-mail：915934926@qq.com

#通信作者：主任藥師，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：腫瘤化療耐藥。電話：023-68812151。E-mail：chenjh-110@263.net

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.05