高產高油桂郁金種質的篩選Δ

靳雅惠，楊傳強，王 建（廣西中醫藥大學藥學院，南寧 530001）

高產高油桂郁金種質的篩選Δ

靳雅惠＊，楊傳強，王 建#（廣西中醫藥大學藥學院，南寧 530001）

目的：建立分析高產高油桂郁金揮發油的方法，以期為桂郁金良種選育繁育提供參考。方法：采用氣相色譜-質譜聯用法。色譜條件：色譜柱為HP-5MS石英彈性毛細管柱，載氣為高純氦氣（99.999%），載氣流量為1.0 mL/min，進樣口溫度為250 ℃，色譜柱初始溫度為50℃ （程序升溫），分流進樣，分離比為10∶1。質譜條件：電離方式為電子轟擊離子源，電離能量為70 eV，離子源溫度為230℃ ，四極桿溫度為150℃ ，傳輸線溫度為280℃ ，電子倍增器電壓為1 588 V，質量掃描范圍為m/z 45～500。從100株不同種質樣品中篩選產量大、含油量高的桂郁金較好種質，比較篩選單株的揮發油成分及各成分的相對含量，采用SPSS 22.0統計軟件進行聚類分析。結果：共篩選出10個桂郁金高產高油種質，鑒定出54種化合物，10個不同種質的桂郁金揮發油共有成分為樟腦、1-石竹烯、γ-欖香烯、莪術烯、吉馬酮、新莪術二酮，大多數種質含有龍腦、異龍腦、δ-欖香烯、大根香葉烯、白菖烯。C78、C104、藥用2的產量、揮發油含量以及揮發油中有效成分相對含量均較高。10個桂郁金高產高油種質可以分為3類。結論：該研究基本明確了高產高油桂郁金揮發油的主要化學成分，C78、C104、藥用2為高產高油桂郁金種質中較優良的品系。

桂郁金；種質；揮發油成分；高產；高油

桂郁金來源于姜科植物廣西莪術Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang的干燥塊根，又名莪苓，是2015年版《中國藥典》（一部）規定的郁金的來源之一，具有活血止痛、行氣解郁、清心涼血、利膽退黃之功效，主治胸脅刺痛、胸痹心痛、經閉痛經等癥[1]。

郁金的主要化學成分為揮發油和姜黃素類[2]，其揮發油的藥理作用和莪術油[3]類似，包括保肝利膽、降血脂等[4]。由于郁金來源不同，使其揮發油含量及成分差異顯著[5]。桂郁金作為郁金的主流品種，占全國郁金總產量的60%[6]，現已廣泛應用于臨床。從已有文獻報道中可以了解到，近些年來對于郁金的研究主要集中于化學成分[7]、藥理作用[8]以及多糖類[9]、倍半萜類[10]、微量元素[11]的提取與含量檢測等方面，另外在炮制加工、配伍、采收期等對藥材質量的影響以及生長規律方面研究也有涉足，如翁金月等[12]對不同產地的溫郁金揮發油進行了成分與含量測定，王曉華等[13]對廣西莪術葉與塊根（郁金）、塊莖（莪術）的揮發油成分進行了對比分析。但所有文獻中均未見對不同種質桂郁金的揮發油進行相關報道，且桂郁金在種質評價上也存在很大的研究空白。然而，從魏斯曼提出的“種質學說”可知，種質是保留在生殖細胞染色體上的遺傳物質，通過親代傳遞給后代。種質的差異可能直接影響藥材的質量和藥效[14]，因此為了使桂郁金藥材質量規范化，保障臨床療效最大化，迫切需要進行桂郁金的育種研究。在本試驗中，筆者以單株桂郁金的產量、揮發油含量及成分為考察種質是否優良的指標，探討了不同種質桂郁金的內在差異，以期篩選出優良的桂郁金種質，為該藥材的質量評價提供依據。

1 材料

1.1 儀器

T200型電子分析天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；HDM2000型電熱套（常州國華電器有限公司）；Agilent 7890N/5975N氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）儀（美國Agilent公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：200 W，頻率：40 kHz）；TGL-16G型離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 試劑

試驗所用試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 藥材

本試驗所用藥材均為不同種質的桂郁金單株，共100株。前期分別采自南寧、橫縣、貴港、金秀等地，統一種植于南寧市仙葫種植基地，管理條件相同，經廣西中醫藥大學王建教授鑒定為真品。

2 方法與結果

2.1 高產高油桂郁金種質的篩選

以單株桂郁金的產量和揮發油的百分含量為考察指標，對100株不同種質的桂郁金連續3年進行篩選。試驗所測桂郁金質量為鮮品質量，即采收桂郁金后，清洗干凈，稍微晾干稱得鮮質量。篩選出單株桂郁金產量位于前10%的種質（10株，均＞150.0 g），詳見表1。

表1 不同種質類型桂郁金連續3年測量結果平均值Tab 1 Average measurement results for different germplasms of C.kwangsiensis in 3 consecutive years

稱取藥材樣品150.0 g，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加水500 mL，提取回流6次（110 ），冷卻時間約30 min，測定揮發油體積、記錄顏色，并計算藥材的揮發油含量。收集上層揮發油置于1.5 mL離心管中，密封，置于冰箱貯藏備用。篩選出單株桂郁金揮發油含量位于前10%的種質（10株，均＞0.05 mL），詳見表1。

由表1可知，單株桂郁金的質量差異明顯，均值的變化范圍在162.7～682.3 g之間，揮發油含量的均值變化范圍在0.34%～1.21%之間；單株質量平均值最大的是C104，同時它的桂郁金數量以及揮發油含量均最高，顏色呈褐色。有5種類型單株連續3年質量平均值超過200.0 g，3種類型單株連續3年數量平均值不少于20個，且各年之間差異較小。揮發油的顏色和含量存在一定關聯，含量增加的同時，其顏色逐漸變暗，從近無色到褐色。

2.2 試驗條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：HP-5MS石英彈性毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：高純氦氣（99.999%）；載氣流量：1.0 mL/min；進樣口溫度：250 ；色譜柱初始溫度：50 ，程序升溫（以20 /min的速率升溫至160 ，保持1 min；以5 /min的速率升溫至180 ，保持1 min；以2 /min的速率升溫至200 ，保持2 min；再以20 /min的速率升溫至280 ，保持1 min）；分流進樣，分離比：10∶1。

2.2.2 質譜條件 電離方式：電子轟擊離子源；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ：四極桿溫度：150 ；傳輸線溫度：280；電子倍增器電壓：1 588 V；質量掃描范圍：m/z 45～500。

2.3 供試品溶液的制備

量取“2.1”項下桂郁金揮發油0.1 mL，置于1.5 mL離心管中，加無水乙醚溶解，待溶解后加入適量無水硫酸鈉除去供試品的水分，超聲處理5 min，以半徑為7 cm、3 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.4 揮發油的GC-MS分析

取“2.3”項下供試品溶液適量，按“2.2”項下試驗條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。篩選出匹配度（SI）＞90的化合物，利用NIST 08標準質譜圖庫以及人工進行解析，共鑒定出了54種主要化合物，詳見表2。由表2可知，10株不同種質的桂郁金揮發油共有成分為樟腦、1-石竹烯、γ-欖香烯、莪術烯、吉馬酮、新莪術二酮，大多數種質含有龍腦、異龍腦、δ-欖香烯、大根香葉烯、白菖烯等成分。

圖1 桂郁金揮發油的GC-MS色譜圖（C104）Fig 1 GC-MS chromatogram of C.Kwangsi-ensis high-oil（C104）

利用HPMSD工作站數據處理系統，通過峰面積歸一化法計算揮發油中各化合物的相對含量，詳見表2。結果表明，不同樣品揮發油中所含的化合物種類和相對含量差異較大；C104的吉馬酮相對含量高達34.88%，其余9株種質的平均值為22.68%；僅在C104中未檢測到δ-欖香烯和大根香葉烯，在其余種質中均有分布；C78中莪術烯相對含量高達28.68%，其余9株種質的平均值為18.89%；藥用2中新莪術二酮相對含量高達32.09%，其余9個種質的平均值為12.48%；B106中莰烯相對含量為3.00%，而玉22中相對含量為0.03%，相差達100倍；β-谷甾醇僅在D3中檢出，相對含量為6.69%；旱麥草烯僅在C39中檢出，相對含量為2.35%；2-茨醇僅在A12中檢出，相對含量為1.67%。從B106中檢測到的化合物種類最為豐富，α-水芹烯、3-蒈烯、雙戊烯、萜品烯、萜品油烯、B-廣藿香烯、α-愈創木烯等化合物均為其特有成分。

表2 不同種質桂郁金揮發油成分分析Tab 2 Composition analysis of volatile oil from different germplasms of C.kwangsiensis

續表2Continued Tab 2

2.5 聚類分析

由表2可知，有效成分莪術烯、吉馬酮、新莪術二酮的相對百分含量較其他共有成分均高出了許多。運用SPSS 22.0統計軟件進行聚類分析，以莪術烯、吉馬酮、新莪術二酮、單株質量、揮發油含量為變量，采用組間連接的聚類方法，以夾角余弦為樣品相似度的距離公式，進行聚類分析，詳見圖2。10株種質可以分為三大類，Ⅰ類包括C78、A12、B6、D3、C39、C62、玉22、B106共8株種質；Ⅱ類以藥用2獨自聚為一類；Ⅲ類以C104獨自聚為一類。原因可能是種質間的差異。由聚類結果可知，C78、C104、藥用2屬于不同類別，相似性較小，但產量、揮發油含量以及有效成分相對含量較其余種質均較高，為優良的桂郁金品系。

圖2 不同種質桂郁金聚類分析圖Fig 2 Clustering analysis diagram of different germplasms of C.kwangsiensis

4 討論

在實際采收過程中，由于不定根的生長導致了桂郁金的生長輻射范圍較大較深，可能造成了少許數量的桂郁金并沒有被采挖出來，從而影響數據的準確度。為了盡可能地降低干擾，可以借鑒其他植物的地膜覆蓋、套袋等技術尋求先進的桂郁金種植方法，使采收過程化繁為簡，提高試驗的準確性。

桂郁金藥材中揮發油的質量是由遺傳物質（種質）和環境因素（產地等）共同決定的，本試驗將藥材統一種植于基地，避免了環境因素對于揮發油質量的干擾，結果所表現出來的揮發油種類及相對含量的差異實際上是由種質的遺傳差異導致的。然而，目前的相關研究卻只重視產地而忽略了種質的巨大影響，使得桂郁金的良種選育工作進展緩慢[15]。今后，應高度重視種質的差異，兼顧產地的影響，確保藥材的療效。

本研究從100株不同種質的桂郁金中篩選出了10株高產高油種質，并對其揮發油成分進行了分析。通過篩選出SI＞90的化合物，利用NIST 08標準質譜圖庫以及人工進行解析，確保了試驗的專屬性。同時，篩選出峰面積大于一定數值的峰進行統計，確保了所統計的峰面積相對較大，故未涉及檢測限和定量限的考察。本研究利用HPMSD工作站數據處理系統，通過峰面積歸一化法得出揮發油中各化合物的相對含量，而非絕對含量，故未涉及線性、重復性、穩定性等方法學考察。在桂郁金揮發油成分中，共有成分包括樟腦、1-石竹烯、γ-欖香烯、莪術烯、吉馬酮、新莪術二酮，為文獻報道的郁金的有效成分[12]，在各種質中出峰時間大致相同，但相對含量差異明顯。通過聚類分析，綜合不同種質桂郁金的產量、揮發油含量及有效成分相對含量等3個方面，C78、C104、藥用2為優良的桂郁金品系，本研究結果可以為良種繁育工作以及保障臨床療效的發揮提供參考。同時，桂郁金中姜黃素類成分的藥理作用包括抗氧化、抗腫瘤等，在后期試驗中可以進行姜黃素類成分的含量測定，也可以采用SSR分子標記輔助育種等方式，探討各種質的遺傳多樣性及其親緣關系，篩選出更加優良的桂郁金種質。

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Screening of High-yield and High-oil Curcuma kwangsiensis

JIN Yahui，YANG Chuanqiang，WANG Jian（School of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China）

OBJECTIVE：To establish a method for analyzing the volatile oil of high-yield and high-oil Curcuma kwangsiensis，and to provide reference for its breeding.METHODS：GC-MS was performed on the column of HP-5MS quartz elastic capillary column，carrier gas was high purity helium（99.999%），flow rate was 1.0 ml/min，inlet temperature was 250℃ ，the initial temperature of column was 50 ℃（temperature programmed），split injection with split ratio of 10∶1.Mass spectrometry conditions：ionization mode was the electron impact ion source，ionization energy was 70 eV，the ion source temperature was 230℃ ，the quadrupole temperature was 150 ℃，transmission line temperature was 280 ℃，the electron multiplier voltage was 1 588 V，and mass scanning range was m/z 45 to 500.High-yield and high-oil germplasm of were screened from 100 different germplasms，the volatile oil composition of single plant and relative percentage contents of each composition were compared，SPSS 22.0 software was used for cluster analysis.RESULTS：Totally 10 high-yield and high-oil germplasm were screened，54 kinds of compounds were identified，the common compositions of 10 different germplasms were camphor，1-caryophyllene，γ-elemene，curcumene，gemma ketone and new curdione，most germplasms contained borneol，isoborneol，δ-elemene，germacrene and calamine.The C78，C104，purpose 2，volatile oil content and relative percentage contents of active compositions in volatile oil were high.The 10 high-yield and high-oil germplasms can be divided into 3 groups.CONCLUSIONS：The study basically clears the main chemicalcomposition of volatile oil of high-yield and high-oil C.kwangsiensis，C78，C104 and purpose 2 are the more excellent strains in high-yield and high-oil C.Kwangsiensis germplasm.

Curcuma Kwangsiensis；Germplasm；Volatile oil components；High-yield；High-oil

R284.1

A

1001-0408（2017）12-1673-04

2016-08-05

2016-09-27）

（編輯：張 靜）

國家自然科學基金資助項目（No.81160500）；廣西科技廳課題（No.桂科攻1099063-2）；廣西研究生教育創新計劃資助項目（No.YCSZ2015181）

＊碩士研究生。研究方向：藥用植物栽培和育種。E-mail：sxyajyh@126.com

#通信作者：教授。研究方向：藥用植物栽培和育種。E-mail：gxzyywj@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.12.25