鹽酸小檗堿對顱腦創傷模型小鼠雙側丘腦繼發性損傷的神經保護作用

黃樹宣 朱飛奇 裴中鄧 旭輝楊 志朱瑾 陳淳淳 林偉豐

·基礎研究·

鹽酸小檗堿對顱腦創傷模型小鼠雙側丘腦繼發性損傷的神經保護作用

黃樹宣 朱飛奇 裴中鄧 旭輝楊 志朱瑾 陳淳淳 林偉豐

目的探討鹽酸小檗堿對顱腦創傷（TBI）模型小鼠雙側丘腦繼發性損傷（炎癥反應、氧化損傷和神經元缺失）的神經保護作用。方法采用自由落體撞擊法制備顱腦創傷模型，鹽酸小檗堿組小鼠予以鹽酸小檗堿50 mg/（kg·d）灌胃21 d，TBI組予等量生理鹽水灌胃21 d，對照組不予自由落體撞擊。免疫組織化學染色計數雙側丘腦誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、環氧合酶?2（COX?2）、8?羥基脫氧鳥苷（8?OHdG）和神經元核抗原（Neu N）陽性神經元或膠質細胞數目，免疫熒光染色計數雙側丘腦膠質纖維酸性蛋白（GFAP）陽性星形膠質細胞和離子鈣結合蛋白1（Iba1）陽性小膠質細胞數目。結果3組小鼠顱腦創傷同側丘腦iNOS（P=0.015）、COX?2（P=0.022）、8?OHdG（P=0.000）和Neu N（P=0.000）陽性神經元或膠質細胞數目以及GFAP陽性星形膠質細胞數目（P=0.024）和Iba1陽性小膠質細胞數目（P= 0.000）差異均有統計學意義，其中，TBI組iNOS（P=0.005）、COX?2（P=0.011）和8?OHdG（P=0.000）陽性神經元或膠質細胞數目以及GFAP陽性星形膠質細胞數目（P=0.011）和Iba1陽性小膠質細胞數目（P= 0.000）均高于對照組，而Neu N陽性神經元數目低于對照組（P=0.000）；鹽酸小檗堿組iNOS（P=0.031）、COX?2（P=0.024）和8?OHd G（P=0.008）陽性神經元或膠質細胞數目以及GFAP陽性星形膠質細胞數目（P=0.031）和Iba1陽性小膠質細胞數目（P=0.012）均低于TBI組，僅8?OHdG陽性神經元數目（P= 0.014）和Iba1陽性小膠質細胞數目（P=0.024）仍高于對照組，而Neu N陽性神經元數目高于TBI組（P= 0.016）、仍低于對照組（P=0.027）。3組小鼠顱腦創傷對側丘腦僅COX?2（P=0.029）和8?OHd G（P= 0.000）陽性神經元或膠質細胞數目差異有統計學意義，其中，TBI組COX?2（P=0.011）和8?OHd G（P= 0.000）陽性神經元或膠質細胞數目高于對照組，鹽酸小檗堿組COX?2（P=0.047）和8?OHd G（P=0.010）陽性神經元或膠質細胞數目低于TBI組，僅8?OHd G陽性神經元數目仍高于對照組（P=0.004）。結論顱腦創傷可以引起雙側丘腦繼發性損傷，尤以同側丘腦顯著，對側丘腦僅出現炎癥反應和氧化損傷；鹽酸小檗堿通過抑制顱腦創傷后雙側丘腦炎癥反應和氧化損傷而發揮神經保護作用。

小檗堿；顱腦損傷；丘腦；炎癥；氧化性應激；神經元；疾病模型，動物

【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effect of berberine chloride on secondary damage(inflammation,oxidative damage and neuron loss)in bilateral thalami of traumatic brain injury(TBI) model mice.MethodsMice were randomly divided into 3 groups:control group(N=6),TBI group(N=6) and berberine group(N=6).TBI model was established by a free?falling hitting device.In control group, mice were not given free?falling hitting.Mice in berberine group were given a gavage of berberine chloride [50 mg/（kg·d)]for 21 d,while mice in TBI group were given the same dosage of normal saline for 21 d. Immunohistochemistry was used to count the number of neurons or gliocytes positive for inducible nitric oxide synthase(iNOS),cyclooxygenase?2(COX?2),8?hydroxy deoxyguanosine(8?OHdG)and neuronal nuclei (NeuN),the number of astrocytes positive for glial fibrillary acidic protein(GFAP)and the number of microglias positive for ionized calcium?binding adaptor molecule 1(Iba1).ResultsThe number of neurons or gliocytes positive for iNOS(P=0.015),COX?2(P=0.022),8?OHdG(P=0.000)and Neu N(P= 0.000),the number of astrocytes positive for GFAP(P=0.024)and microglias positive for Iba1(P=0.000) in TBI ipsilateral thalamus were significantly different among 3 groups.In TBI group,the number of neurons or gliocytes positive for iNOS(P=0.005),COX?2(P=0.011)and 8?OHd G(P=0.000),the number of astrocytes positive for GFAP(P=0.011)and microglias positive for Iba1(P=0.000)were significantly higher than those in control group,while the number of neurons positive for Neu N(P=0.000)was significantly lower than that in control group.In berberine group,the number of neurons or gliocytes positive for iNOS(P=0.031),COX?2(P=0.024)and 8?OHdG(P=0.008),the number of astrocytes positive for GFAP(P=0.031)and microglias positive for Iba1(P=0.012)were significantly lower than those in TBI group,while the number of neurons positive for 8?OHd G(P=0.014)and microglias positive for Iba1(P= 0.024)were significantly higher than those in control group.The number of neurons positive for Neu N in berberine group was significantly higher than that in TBI group(P=0.016),while lower than that in control group(P=0.027).Additionally,number of neurons or gliocytes positive for COX?2(P=0.029)and 8?OHdG (P=0.000)in TBI contralateral thalamus were significantly different among 3 groups.The number of neurons or gliocytes positive for COX?2(P=0.011)and 8?OHd G(P=0.000)in TBI group was significantly higher than that in control group,while the number of neurons or gliocytes positive for COX?2(P=0.047) and 8?OHd G(P=0.010)in berberine group was significantly lower than that in TBI group.The number of neurons positive for 8?OHd G in berberine group was significantly higher than that in control group(P= 0.004).ConclusionsTBI could cause secondary damage of bilateral thalami,especially in ipsilateral thalamus,but only cause inflammation and oxidative damage in contralateral thalamus.Berberine chloride might exert neuroprotective effect on bilateral thalami after TBI by significantly suppressing inflammation and oxidative damage.

This study was supported by Natural Science Foundation of Guangdong Province,China(No. S2013010015786)and Science and Technology Plan Project of Shaoguan,Guangdong Province,China(No. 2010-01).

顱腦創傷（TBI）導致的繼發性腦損傷不僅可以發生在原發部位，還可以發生在遠隔海馬、基底節和丘腦等其他部位［1?2］，是顱腦創傷高病殘率和高病死率的重要原因，也是影響患者預后的關鍵。丘腦是大腦重要而復雜的中繼站，與大腦皮質存在廣泛纖維聯系，不僅與感覺傳導有關，而且與認知和行為密切相關，丘腦損傷可以導致感覺障礙、視覺障礙、睡眠障礙和認知功能障礙［3］。近年研究顯示，小檗堿（又稱黃連素）具有抗炎癥反應、抗氧化應激、降低膽固醇等多種藥理學作用，在中樞神經系統疾病中發揮重要神經保護作用［4?5］。本研究制備顱腦創傷小鼠模型，觀察顱腦創傷后小鼠雙側丘腦炎癥反應、氧化損傷和神經元缺失情況，并予以鹽酸小檗堿治療，探討該藥對顱腦創傷模型小鼠雙側丘腦繼發性損傷（炎癥反應、氧化損傷和神經元缺失）的影響，以為臨床能夠更有效治療顱腦創傷提供理論依據。

材料與方法

一、實驗材料

1.實驗動物無特定病原體（SPF）雌性C57BL/ 6小鼠共18只，月齡6個月，體重25～31 g、平均（27.67±1.88）g，由中山大學實驗動物中心提供［許可證號：SYXK（粵）2010-0107］，于室溫（22±2）℃、相對濕度（50±5）%、12 h晝-12 h夜循環照明環境中飼養，自由攝食、飲水。

2.試劑與儀器（1）主要試劑：鹽酸小檗堿（規格：500 mg）由美國Sigma?Aldrich公司提供。Ⅰ抗工作液中兔抗小鼠誘導型一氧化氮合酶（iNOS）多克隆抗體（1∶200）為美國Proteintech公司產品，兔抗小鼠環氧合酶?2（COX?2）多克隆抗體（1∶200）由美國Bioworld公司提供，山羊抗小鼠8?羥基脫氧鳥苷（8?OHd G）多克隆抗體（1∶200）為美國Calbiochem公司產品，兔抗小鼠神經元核抗原（NeuN）單克隆抗體（1∶200）購自英國Abcam公司，兔抗小鼠膠質纖維酸性蛋白（GFAP）單克隆抗體（1∶500）為英國Abcam公司產品，兔抗小鼠離子鈣結合蛋白1（Iba1）單克隆抗體（1∶500）由日本和光純藥工業株式會社提供。辣根過氧化物酶（HRP）標記的驢抗山羊IgGⅡ抗（1∶500）購自美國Life公司，辣根過氧化物酶標記的驢抗兔IgGⅡ抗（1∶500）由丹麥Dako公司提供，Alexa Fluor 555標記的山羊抗兔熒光IgGⅡ抗（1∶500）購自美國Life公司。（2）主要儀器：顱腦創傷撞擊器為北京拜安吉科技有限公司產品，腦立體定位儀由深圳市瑞沃德生命科技有限公司提供，小鼠顱骨鉆為韓國Saeshin公司產品，光學顯微鏡購自日本Nikon公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，CM1950型冰凍切片機由德國Leica公司提供。

二、研究方法

1.動物模型制備與分組（1）模型制備：采用自由落體撞擊法制備顱腦創傷小鼠模型，在電熱毯上以體積分數為4.2%水合氯醛（0.10 ml/10 g）腹腔注射全身麻醉，顱骨正中切開一長約1.50 cm頭皮切口，矢狀縫旁左側、冠狀縫和人字縫之間開一直徑約5 mm骨窗，以20 g砝碼自高度為20 cm處垂直自由下落，以預先消毒的撞擊針頭撞擊骨窗。撞擊后以骨蠟封閉骨窗，消毒后縫合頭皮，將小鼠置于電熱爐旁觀察1 h，待蘇醒后放回籠中飼養。（2）動物分組：采用隨機數字表法隨機分為對照組、顱腦創傷模型組（TBI組）和鹽酸小檗堿治療組（鹽酸小檗堿組），每組各6只小鼠。鹽酸小檗堿組于模型制備后予鹽酸小檗堿50 mg/（kg·d）溶于生理鹽水中灌胃（1次/d），連續21 d；TBI組于模型制備后予等量生理鹽水灌胃（1次/d），連續21 d；對照組僅開骨窗，不予自由落體撞擊。

2.腦組織灌注和冰凍切片制備模型制備后21 d，小鼠腹腔注射4.20%水合氯醛（0.10 ml/10 g）全身麻醉，仰臥位固定，剪開胸腔，顯露心臟，直視下將針頭插入左心室，剪開右心耳，先以4℃生理鹽水50 ml快速心臟灌注，再以4℃質量分數為4%多聚甲醛溶液50～100 ml緩慢灌注。斷頭切取腦組織，置重新配置的4%多聚甲醛溶液中12 h，再依次置于4℃、體積分數為20%和30%的蔗糖溶液中脫水6 h至腦組織標本沉淀。取出腦組織標本，以光學相干斷層掃描術（OCT）包埋劑包埋，于恒冷冰凍切片機上行冠狀位連續切片，層厚10 μm，置?80℃冰箱中保存備用。

3.免疫組織化學染色取出腦組織冰凍切片，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）水化20 min，枸櫞酸微波中火修復5 min，體積分數為0.3%Triton X?100破膜30 min，以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗5 min（×3次），體積分數為3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶15 min，抗原封閉液封閉1 h，滴加Ⅰ抗工作液中兔抗小鼠iNOS多克隆抗體、兔抗小鼠COX?2多克隆抗體、山羊抗小鼠8?OHd G多克隆抗體和兔抗小鼠Neu N單克隆抗體，4℃過夜，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗5 min（×3次），再滴加辣根過氧化物酶標記的驢抗山羊IgGⅡ抗或辣根過氧化物酶標記的驢抗兔IgGⅡ抗，常溫孵育1 h，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗5 min×（4次），二氨基聯苯胺（DAB）顯色1 min，蘇木素復染3 min，中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察。每只小鼠取3張大致相同層面腦組織切片，觀察雙側丘腦iNOS、COX?2、8?Ohd G和Neu N陽性神經元或膠質細胞，隨機選取5個視野（× 400），計數陽性細胞數目。

4.免疫熒光染色取出冰凍切片，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液水化20 min，枸櫞酸微波中火修復約5 min，0.3%Triton X?100破膜30 min，以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗5 min（×3次），抗原封閉液封閉1 h，滴加Ⅰ抗工作液中兔抗小鼠GFAP單克隆抗體和兔抗小鼠Iba1單克隆抗體，4℃過夜，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗5 min（×3次），再滴加Alexa Fluor 555標記的山羊抗兔熒光IgGⅡ抗，于37℃避光孵育1 h，以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗5 min（×4次），含4’，6?二脒基?2?苯基吲哚（DAPI）封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察。每只小鼠取3張大致相同層面腦組織切片，觀察雙側丘腦GFAP陽性星形膠質細胞和Iba1陽性小膠質細胞，隨機選取5個視野（×200），計數陽性細胞數目。

三、統計分析方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理與分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較行LSD?t檢驗。以P≤0.05為差異具有統計學意義。

表1 3組小鼠顱腦創傷同側丘腦炎癥反應、氧化損傷和神經元缺失的比較Table 1.Comparison of inflammation,oxidative damage and neuron loss in TBI ipsilateral thalamus among 3 groups

表1 3組小鼠顱腦創傷同側丘腦炎癥反應、氧化損傷和神經元缺失的比較Table 1.Comparison of inflammation,oxidative damage and neuron loss in TBI ipsilateral thalamus among 3 groups

TBI，traumatic brain injury，顱腦創傷；iNOS，inducible nitric oxide synthase，誘導型一氧化氮合酶；COX?2，cyclooxygenase?2，環氧合酶?2；8?OHd G，8?hydroxy deoxyguanosine，8?羥基脫氧鳥苷；NeuN，neuronal nuclei，神經元核抗原；GFAP，glial fibrillary acidic protein，膠質纖維酸性蛋白；Iba1，ionized calcium?binding adaptor molecule 1，離子鈣結合蛋白1。The same for table below

Group Control TBI Berberine F value P value N 6 6 6 iNOS 9.89±4.17 16.89±4.55 11.78±1.85 5.682 0.015 COX?2 8.04±4.92 16.88±6.88 9.23±3.48 4.945 0.022 8?OHdG 16.66±3.70 33.32±7.30 24.63±2.50 17.058 0.000 NeuN 22.56±3.00 16.52±1.39 19.69±1.16 13.369 0.000 GFAP 16.67±8.06 29.33±9.39 19.00±4.06 4.816 0.024 Iba1 11.30±3.69 28.92±6.76 19.53±6.11 14.469 0.000

結果

一、鹽酸小檗堿對顱腦創傷模型小鼠同側丘腦炎癥反應、氧化損傷和神經元缺失的影響

3組小鼠顱腦創傷同側丘腦iNOS（P=0.015）、COX?2（P=0.022）、8?OHd G（P=0.000）和Neu N（P= 0.000）陽性神經元或膠質細胞數目差異均有統計學意義（表1）。TBI組iNOS（P=0.005）、COX?2（P= 0.011）和8?OHd G（P=0.000）陽性神經元或膠質細胞數目均高于對照組，Neu N陽性神經元數目低于對照組（P=0.000）。鹽酸小檗堿組iNOS（P=0.031）、COX?2（P=0.024）和8?OHd G（P=0.008）陽性神經元或膠質細胞數目均低于TBI組，其中iNOS和COX?2陽性神經元或膠質細胞數目降至正常水平（均P> 0.05）、8?OHd G陽性神經元數目仍高于對照組（P= 0.014）；而Neu N陽性神經元數目高于TBI組（P= 0.016），但仍低于對照組（P=0.027，圖1）。3組小鼠顱腦創傷同側丘腦GFAP陽性星形膠質細胞數目（P=0.024）和Iba1陽性小膠質細胞數目（P=0.000）差異亦有統計學意義（表1）。對照組星形膠質細胞和小膠質細胞數目較少，TBI組星形膠質細胞和小膠質細胞數目明顯增加（P=0.011，0.000），鹽酸小檗堿組星形膠質細胞和小膠質細胞增殖受到抑制，細胞數目少于TBI組（P=0.031，0.012），其中星形膠質細胞數目降至正常水平（P>0.05）、小膠質細胞數目仍高于對照組（P=0.024，圖2）。

二、鹽酸小檗堿對顱腦創傷模型小鼠對側丘腦炎癥反應、氧化損傷和神經元缺失的影響

3組小鼠顱腦創傷對側丘腦COX?2（P=0.029）和8?OHd G（P=0.000）陽性神經元或膠質細胞數目差異均有統計學意義，而iNOS和Neu N陽性神經元或膠質細胞數目以及GFAP陽性星形膠質細胞和Iba1陽性小膠質細胞數目差異均無統計學意義（P> 0.05，表2）。TBI組COX?2（P=0.011）和8?OHd G（P=0.000）陽性神經元或膠質細胞數目均高于對照組；鹽酸小檗堿組COX?2（P=0.047）和8?OHd G（P= 0.010）陽性神經元或膠質細胞數目均低于TBI組，其中COX?2陽性神經元或膠質細胞數目降至正常水平（P>0.05）、8?OHd G陽性神經元數目仍高于對照組（P=0.004，圖3）。

討論

顱腦創傷可在原發部位形成病灶，原發部位的繼發性腦損傷亦是當前顱腦創傷的研究熱點，因此，大量關于顱腦創傷的研究易忽略遠隔部位的繼發性改變。在本研究中，我們發現顱腦創傷第21天小鼠雙側丘腦均存在炎癥反應和氧化損傷的繼發性改變，同側丘腦甚至出現神經元缺失，與McAllister［6］報告的顱腦創傷可以導致遠隔部位繼發性損傷的結果相一致。我們觀察到TBI組小鼠顱腦創傷同側丘腦星形膠質細胞和小膠質細胞增殖活化、iNOS和COX?2表達、氧化損傷、神經元缺失均較對照組明顯，且TBI組神經細胞形態也發生改變，表現為細胞輪廓不清、軸突難辨、胞體變小、胞核固縮，推測這種神經細胞形態改變是炎癥反應和氧化損傷加重所致。小膠質細胞和星形膠質細胞是中樞神經系統炎癥反應的主要參與者［7?8］，前者可以釋放氧自由基、一氧化氮（NO）、炎性因子等加重神經損傷［9?10］；后者不僅可以釋放炎性因子，還可以在損傷區域形成膠質瘢痕，對軸索修復和再生產生機械性阻礙屏障［11］。iNOS和COX?2是炎癥反應的關鍵酶，在炎癥反應中起重要作用，減少iNOS和COX?2過表達可以發揮神經保護作用［12?13］；氧化損傷在顱腦創傷中也可以通過氧自由基釋放、脂質過氧化或刺激炎癥反應以對神經元產生損害作用［14?15］。在本研究中，我們還發現TBI組小鼠顱腦創傷對側丘腦COX?2和8?OHd G表達水平較對照組明顯增加，而星形膠質細胞和小膠質細胞增殖活化、iNOS表達水平、神經元缺失數目與對照組差異無統計學意義，這可能是由于顱腦創傷模型在原發部位的損傷較輕，也可能是由于損傷時間較長，對側丘腦繼發性炎癥反應逐漸減輕，出現神經修復和再生。

圖1 光學顯微鏡觀察，對照組顱腦創傷同側丘腦iNOS、COX?2和8?OHd G陽性神經元或膠質細胞數目較少、神經元數目較多且形態完整，TBI組iNOS、COX?2和8?OHdG陽性神經元或膠質細胞數目增加、神經元數目減少，鹽酸小檗堿組iNOS、COX?2和8?OHdG陽性神經元或膠質細胞數目明顯減少、神經元數目增加且形態完整免疫組織化學染色（EnVision二步法）×400Figure 1Optical microscopy findings In control group,number of neurons or gliocytes positive for iNOS,COX?2 and 8?OHd G was small in TBI ipsilateral thalamus,the number of neurons was large,and the neurons were intact in morphology.In TBI group, the number of neurons or gliocytes was significantly increased,the number of neurons was decreased.In berberine group,the number of neurons or gliocytes was significantly reduced,the number of intact neurons was increased.Immunohistochemical staining(En Vision)×400

在本研究中，我們還觀察到鹽酸小檗堿對顱腦創傷模型小鼠雙側丘腦炎癥反應和氧化損傷均有抑制作用，并增加同側丘腦神經元存活數目。既往大量研究顯示，小檗堿在細胞水平或其他動物模型上具有抗炎癥反應、抗氧化應激等作用：Chen等［16］通過腹腔注射鹽酸小檗堿以抑制神經炎癥反應，從而發揮神經保護作用；Ye等［17］發現，在脂肪組織和脂肪細胞中，小檗堿可以抑制巨噬細胞激活、減少腫瘤壞死因子?α（TNF?α）和白細胞介素?1（IL?1）釋放，從而改善胰島素抵抗；有文獻報道，小檗堿通過腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）通路抑制小膠質細胞活化，下調炎性因子iNOS和COX?2表達，從而發揮抑制神經炎癥反應的作用［18］；亦有研究顯示，小檗堿可以減弱酒精性肝病小鼠模型氧化應激和脂質過氧化［19］；在6?羥基多巴胺（6?OHDA）誘導的帕金森病動物模型中，小檗堿通過抗氧化反應減少多巴胺能神經元缺失，并改善運動功能［20］。但在顱腦創傷模型中，小檗堿對雙側丘腦炎癥反應、氧化損傷的影響尚未見諸報道，本研究證實鹽酸小檗堿能夠通過抑制炎癥反應和氧化損傷來對雙側丘腦產生神經保護作用。在本研究中，TBI組小鼠雙側丘腦均出現較嚴重的氧化損傷，且同側丘腦炎癥反應較對側丘腦更嚴重，甚至出現神經元缺失，因此我們推測，丘腦神經損害作用可能是以炎癥反應介導為主，而鹽酸小檗堿對顱腦創傷后丘腦的神經保護作用可能是同時通過抗炎癥反應和抗氧化損傷的作用來介導的。

圖2 熒光顯微鏡觀察顯示，對照組顱腦創傷同側丘腦GFAP陽性星形膠質細胞和Iba1陽性小膠質細胞數目較少，TBI組GFAP陽性星形膠質細胞和Iba1陽性小膠質細胞數目明顯增加，鹽酸小檗堿組GFAP陽性星形膠質細胞和Iba1陽性小膠質細胞數目明顯減少免疫熒光染色×200Figure 2Fluorescent microscopy findings The number of astrocytes positive for GFAP and microglias positive for Iba1 in TBI ipsilateral thalamus was small in control group,but was significantly increased in TBI group and significantly reduced in berberine group.Immunofluorescent staining×200

綜上所述，顱腦創傷后雙側丘腦均出現炎癥反應、氧化損傷等繼發性腦損傷，甚至同側丘腦出現神經元缺失，鹽酸小檗堿可以顯著抑制顱腦創傷后雙側丘腦炎癥反應和氧化損傷，并增加同側丘腦神經元存活數目，可能為未來更有效治療顱腦創傷提供新的方向。

表2 3組小鼠顱腦創傷對側丘腦炎癥反應、氧化損傷和神經元缺失的比較Table 2. Comparison of inflammation,oxidative damage and neuron loss in TBI contralateral thalamus among 3 groups

表2 3組小鼠顱腦創傷對側丘腦炎癥反應、氧化損傷和神經元缺失的比較Table 2. Comparison of inflammation,oxidative damage and neuron loss in TBI contralateral thalamus among 3 groups

Group Control TBI Berberine F value P value N 6 6 6 iNOS 11.70±1.28 12.89±2.45 10.55±2.09 2.057 0.162 COX?2 9.34±3.63 15.19±4.60 10.79±1.67 4.508 0.029 8?OHdG 18.13±6.09 29.17±2.50 24.05±2.57 19.854 0.000 NeuN 23.29±2.95 22.42±1.80 20.00±2.35 2.982 0.081 GFAP 15.93±3.38 18.21±4.40 16.27±3.88 0.595 0.564 Iba1 12.80±2.63 14.97±2.11 15.67±2.37 2.378 0.127

圖3 光學顯微鏡觀察顯示，對照組顱腦創傷對側丘腦COX?2和8?OHd G陽性神經元或膠質細胞數目較為少見，TBI組COX?2和8?OHd G陽性神經元或膠質細胞數目明顯增加，鹽酸小檗堿組COX?2和8?OHd G陽性神經元或膠質細胞數目明顯減少免疫組織化學染色（EnVision二步法）×400Figure 3Optical microscopy findings The number of neurons or gliocytes positive for COX?2 and 8?OHdG in TBI contralateral thalamus was small in control group,but was significantly increased in TBI group and was significantly reduced in berberine group.Immunohistochemical staining(EnVision)×400

［1］Hermans L,Beeckmans K,Michiels K,Lafosse C,Sunaert S, Coxon JP,Swinnen SP,Leunissen I.Proactive response inhibition and subcortical gray matter integrity in traumatic brain injury.Neurorehabil Neural Repair,2017,31:228?239.

［2］Leh SE,Schroeder C,Chen JK,Chakravarty MM,Park MT, Cheung B,Huntgeburth SC,Gosselin N,Hock C,Ptito A, Petrides M.Microstructural integrity of hippocampal subregions is impaired after mild traumatic brain injury.J Neurotrauma, 2016［.Epub ahead of print］

［3］Mitchell AS,Sherman SM,Sommer MA,Mair RG,Vertes RP, Chudasama Y.Advances in understanding mechanisms of thalamic relays in cognition and behavior.J Neurosci,2014,34: 15340?15346.

［4］Imenshahidi M,Hosseinzadeh H.Berberis vulgaris and berberine:an update review.Phytother Res,2016,30:1745?1764.

［5］Zuo R,Cao XB,Zhang WS.The progress of berberine's pharmacological effects.Huan Qiu Zhong Yi Yao,2014,7:568?572［.左茹,曹雪濱,張文生.黃連素藥理作用研究進展.環球中醫藥,2014,7:568?572.］

［6］McAllister TW.Neurobiological consequences of traumatic brain injury.Dialogues Clin Neurosci,2011,13:287?300.

［7］Carta AR,Mulas G,Bortolanza M,Duarte T,Pillai E,Fisone G, Vozari RR,Del?Bel E.l?DOPA?induced dyskinesia and neuroinflammation:do microglia and astrocytes play a role.Eur J Neurosci,2017,45:73?91.

［8］Sochocka M,Diniz BS,Leszek J.Inflammatory response in the CNS:friend or foe.Mol Neurobiol,2016［.Epub ahead of print］

［9］Rodriguez MJ,Mahy N.Neuron?microglia interactions in motor neuron degeneration:the inflammatory hypothesis in amyotrophic lateral sclerosis revisited.Curr Med Chem,2016.［Epub ahead of print］

［10］Wolf SA,Boddeke HW,Kettenmann H.Microglia in physiology and disease.Annu Rev Physiol,2017,79:619?643.

［11］Kang W,Balordi F,Su N,Chen L,Fishell G,Hebert JM. Astrocyte activation is suppressed in both normal and injured brain by FGF signaling.Proc Natl Acad Sci USA,2014,111: E2987?2995.

［12］Lin C,Lin HY,Chen JH,Tseng WP,Ko PY,Liu YS,Yeh WL, Lu DY.Effects of paeonol on anti?neuroinflammatory responses in microglial cells.Int J Mol Sci,2015,16:8844?8860.

［13］Zhu L,Nang C,Luo F,Pan H,Zhang K,Liu J,Zhou R,Gao J, Chang X,He H,Qiu Y,Wang J,Long H,Liu Y,Yan T. Esculetin attenuates lipopolysaccharide(LPS)?induced neuroinflammatory processes and depressive?like behavior in mice.Physiol Behav,2016,163:184?192.

［14］Halstrom A,MacDonald E,Neil C,Arendts G,Fatovich D, Fitzgerald M.Elevation of oxidative stress indicators in a pilot study of plasma following traumatic brain injury.J Clin Neurosci,2017,35:104?108.

［15］Zhang G,Zhang F,Zhang T,Gu J,Li C,Sun Y,Yu P,Zhang Z, Wang Y.Tetramethylpyrazine nitrone improves neurobehavioral functions and confers neuroprotection on rats with traumatic brain injury.Neurochem Res,2016,41:2948?2957.

［16］Chen CC,Hung TH,Lee CY,Wang LF,Wu CH,Ke CH,Chen SF.Berberine protects against neuronal damage via suppression of glia?mediated inflammation in traumatic brain injury.PLoS One,2014,9:E115694.

［17］Ye L,Liang S,Guo C,Yu X,Zhao J,Zhang H,Shang W. Inhibition of M1 macrophage activation in adipose tissue by berberine improves insulin resistance.Life Sci,2016,166:82?91.

［18］Lu DY,Tang CH,Chen YH,Wei IH.Berberine suppresses neuroinflammatory responses through AMP?activated protein kinase activation in BV?2 microglia.J Cell Biochem,2010,110: 697?705.

［19］Zhang P,Ma D,Wang Y,Zhang M,Qiang X,Liao M,Liu X, Wu H,Zhang Y.Berberine protects liver from ethanol?induced oxidative stress and steatosis in mice.Food Chem Toxicol, 2014,74:225?232.

［20］Zhang C,Li C,Chen S,Li Z,Jia X,Wang K,Bao J,Liang Y, Wang X,Chen M,Li P,Su H,Wan JB,Lee SM,Liu K,He C. Berberine protects against 6?OHDA?induced neurotoxicity in PC12 cells and zebrafish through hormetic mechanisms involving PI3K/AKT/Bcl?2 and Nrf2/HO?1 pathways.Redox Biol,2016,11:1?11.

Protective effect of berberine chloride on secondary damage of bilateral thalami in traumatic brain injury model mice

HUANG Shu?xuan1,ZHU Fei?qi1,PEI Zhong2,DENG Xu?hui1,YANG Zhi1,ZHU Jin?hua1,CHEN Chun?chun1,LIN Wei?feng1

1Department of Neurology,Yuebei People's Hospital Affiliated to Shantou University Medical College, Shaoguan 512026,Guangdong,China

2Department of Neurology,the First Affiliated Hospital,Sun Yat?sen University,Guangzhou 510080, Guangdong,China

Berberine;Craniocerebral trauma;Thalamus;Inflammation;Oxidative stress; Neurons;Disease models,animal

ZHU Fei?qi(Email:zfqzsu2004@aliyun.com)

2017?02?27）

10.3969/j.issn.1672?6731.2017.04.009

廣東省自然科學基金資助項目（項目編號：S2013010015786）；廣東省韶關市科技計劃項目［項目編號：韶科（衛）2010-01］

512026韶關，汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院神經內科［黃樹宣（現在廣州醫科大學附屬第一醫院神經內科，郵政騙碼：510080），朱飛奇（現在廣東省深圳市羅湖區人民醫院神經內科，郵政編碼：518001），鄧旭輝，楊志，朱瑾華,陳淳淳,林偉豐］；510080廣州，中山大學附屬第一醫院神經科（裴中）

朱飛奇（Email：zfqzsu2004@aliyun.com）