TUFT1真核表達質粒的構建及其功能研究

袁孔現，王繼年

(1.銅陵市人民醫院 藥劑科，安徽 銅陵 244002；2.安徽醫科大學第一附屬醫院 教育處，安徽 合肥 230032)

TUFT1真核表達質粒的構建及其功能研究

袁孔現1，王繼年2

(1.銅陵市人民醫院 藥劑科，安徽 銅陵 244002；2.安徽醫科大學第一附屬醫院 教育處，安徽 合肥 230032)

設計合成引物，擴增出TUFT1的CDS序列，雙酶切后連接到pEGFP-C2載體上，將過表達質粒轉染至胰腺癌細胞株中。結果顯示，過表達組細胞的增殖率，顯著高于空白組和對照組；過表達組細胞的凋亡率，顯著低于空白組和對照組。成功構建TUFT1的真核表達載體，并初步確定TUFT1可以明顯增強人胰腺癌細胞株的增殖，同時抑制其凋亡，為進一步探索TUFT1基因功能、尋求治療胰腺癌的新途徑提供了細胞學基礎。

TUFT1；轉染；增殖；凋亡

胰腺癌(PC)作為一種惡性程度非常高的消化系統腫瘤，具有發病隱匿、確診困難、侵襲性強、轉移性高、手術效果差且術后易復發等特點，導致患者病死率居高不下，5年生存率也不容樂觀，有“癌癥之王”的惡稱，嚴重威脅著人類的生命健康[1-4]，因此，對PC發病機制和治療策略的研究迫在眉睫。近些年來，基因工程技術快速發展，為醫學研究和疾病治療開辟了嶄新的道路[5]。TUFT1基因首次發現并克隆于牛的成釉細胞中，其開放閱讀框長度為1 170 bp，編碼一種由390個氨基酸殘基組成的、翻譯修飾前分子量約為44 kDa的親水性蛋白質[6]，國外最新研究表明，TUFT1在胰腺癌組織中存在高表達現象，并提示其在胰腺癌的轉移中扮演著重要角色[7]。本文以此為線索，通過構建TUFT1的真核表達質粒，國內首次研究其對胰腺癌細胞系的增殖和凋亡的影響，為胰腺癌的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

胰腺癌細胞系(Panc-1和BxPC-3)、pEGFP-C2載體均由本實驗室保存。PrimeSTAR Max酶和DNA Marker均購于日本TaKaRa公司；Xho I、BamH I內切酶和T4連接酶均購于加拿大Fermentas公司；膠回收試劑盒和質粒小抽試劑盒均購于美國Axygen公司；細胞凋亡試劑盒購于上海貝博公司；Lip2000脂質體購于Invitrogen公司；GFP抗體購于美國santa cruz公司；DMSO購于日本SIGMA公司；DMEM高糖培養基、Opti-MEM培養液和胎牛血清均購于Gibco公司；引物合成于上海生工生物。

1.2 方法

1.2.1 質粒構建

利用Primer軟件設計引物并送生物公司合成，引物序列如下：F-CCGCTCGAGCGGCATGAACGG GACGCGGAACT；R-CGGGATCCCGTCAGGTTT CCACCACT，利用PCR技術擴增人源TUFT1的CDS片段，并對PCR產物進行瓊脂糖電泳，在紫外分析儀中切取含有目的片段的凝膠，并用膠回收試劑盒純化PCR產物，然后分別用限制性內切酶(Xho I和BamH I)對純化產物和pEGFP-C2空載體進行雙酶切(37 ℃，6 h)，然后用T4連接酶對以上酶切產物進行連接(16 ℃，12 h)，然后用感受態細胞(TG1或DH5a)對連接產物進行轉化并涂布至帶有卡那抗性的LB平板上倒置培養(37 ℃，10～16 h)，然后挑取單克隆進行擴大培養(37 ℃，250 rpm，10～16 h)，并用質粒抽提試劑盒對菌液進行質粒抽提，然后分別用Xho I和BamH I對質粒進行雙酶切鑒定，并將鑒定正確的質粒送生物公司進行測序。

1.2.2 細胞培養和質粒轉染

復蘇細胞后，用完全培養基(90%高糖DMEM+10%胎牛血清+雙抗)進行培養，培養環境為含有5%CO2的37 ℃恒溫培養箱，根據細胞生長速度和狀態，及時進行細胞換液和細胞傳代，并以適當密度重新接種至新的培養瓶中繼續培養。待細胞生長至適當密度(80%～90%)后，進行質粒轉染，轉染步驟如下：分別將適量pEGFP-C2-TUFT1質粒(5～10 μg)和Lip2000脂質體(5～15 μL)加入至500 μL左右的Opti-MEM轉染液中，輕輕混勻后室溫靜置5 min，然后將二者溶液充分混勻后室溫靜置20 min，輕輕加入細胞中并補充適量無雙抗的培養基進行培養，4～6 h后更換成完全培養基繼續培養至24 h。

1.2.3 免疫印跡

質粒轉染48 h后，胰酶消化細胞，低速離心收集細胞后用PBS清洗2～3次，然后加入適量細胞裂解液(RIPA，用前加入PMSF)，4 ℃混旋裂解5～10 min，然后高速低溫離心(4 ℃，14000 rpm/min)10～15 min，并收集適量的裂解上清，加入等量的SDS上樣緩沖液，混勻后沸水浴5～10 min，然后放置冰水中至冷卻，即得到蛋白樣品，取適量樣品進行SDS-PAGE恒壓電泳(80～100 V)約2 h，然后進行恒流電轉(200 mA)約2 h，即得到負載蛋白的PVDF膜，將膜進行封閉(室溫，2 h)后依次孵育GFP一抗(4 ℃，12 h)和二抗(室溫，2 h)，TBST緩沖液洗膜后用ECL液進行顯影。

1.2.4 MTT實驗

胰腺癌細胞(Panc-1和BxPC-3)傳代后重新接種到96孔培養板中(細胞密度約為1×108·L-1)，培養12～24 h后分別轉染0.1 μg左右的pEGFP-C2(作為對照)和pEGFP-C2-TUFT1質粒，48 h后更換為無血清培養基，并加入20 μL MTT(5 g·L-1)，繼續培養4 h，棄去培養基并加入150 μL DMSO，震蕩混勻10 min后，測定492 nm波長處的吸光度。

1.2.5 流式細胞術

胰腺癌細胞(Panc-1和BxPC-3)傳代后重新接種到25 cm2的培養瓶中，培養12～24 h后分別轉染5 μg左右的pEGFP-C2(作為對照)和pEGFP-C2-TUFT1質粒，48 h后收集細胞，并加入400 μL Binding Buffer重懸細胞，并加入5 μL Annexin V染液，輕輕混勻后孵育15 min(4 ℃，避光)，然后加入10 μL PI，輕輕混勻后5 min(4 ℃，避光)，并用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，

1.2.6 統計學處理

利用SPSS軟件19.0對統計數據進行分析，計量數據采用均數±標準差(x±s)來表示，組間對比采用t檢驗，計數資料采用比例表示，組間比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 pEGFP-C2-TUFT1真核表達質粒的酶切

用Xho I和BamH I內切酶對質粒進行雙酶切鑒定，結果顯示，質粒被酶切成兩條帶，與DNA Marker比對發現，一條帶位于4 268 bp和4 973 bp之間，另一條帶位于947 bp和1 375 bp之間，而pEGFP-C2載體和TUFT1片段的大小分別為4.7 kb和1 173 bp，大小均分別位于兩個區間，然后經過pEGFP-C2載體和TUFT1PCR產物的酶切結果的橫向比較，基本可以確定一條是載體pEGFP-C2的條帶，另一條是目的片段TUFT1的條帶，表明質粒連接成功，后續測序結果顯示TUFT1序列正確，表明pEGFP-C2-TUFT1質粒構建成功(圖1)。

圖1 重組質粒pEGFP-C2-TUFT1的酶切鑒定M：DNA Marker；1：pEGFP-C2的酶切；2：重組質粒的酶切；3：TUFT1的PCR產物

2.2 pEGFP-C2-TUFT1真核表達質粒的表達

培養胰腺癌細胞(Panc-1和BxPC-3)，并瞬時轉染約5 μg pEGFP-C2-TUFT1質粒至細胞中，24 h后收集裂解細胞，提取總蛋白后利用蛋白印跡檢測TUFT1蛋白的表達情況，結果顯示，用GFP抗體免疫印跡后，轉染pEGFP-C2-TUFT1組在70 ku左右的位置出現了清晰的條帶，其大小基本與GFP-TUFT1(27 ku+44 ku)一致，而未轉染的空白對照組未檢測到任何條帶，表明pEGFP-C2-TUFT1能夠在細胞中正常表達(圖2)。

2.3 TUFT1對胰腺癌細胞增殖的影響

將胰腺癌細胞(Panc-1和BxPC-3)分成三組，即空白組、對照組和實驗組，空白組不轉染任何質粒，對照組轉染pEGFP-C2空載體質粒，實驗組轉染pEGFP-C2-TUFT1質粒，并利用MTT技術對各組細胞的增殖情況進行檢測和比較，結果顯示空白組和對照組的細胞增殖率分別為0.616±0.048/0.634±0.043和0.610±0.041/0.625±0.047，二者不存在統計學差異(P>0.05)，而觀察組的細胞增值率為0.867±0.045/0.829±0.053，均要顯著高于空白組和對照組(P<0.05)，表明TUFT1的過表達能夠顯著促進胰腺癌細胞(Panc-1和BxPC-3)的增殖，見表1。

圖2 重組質粒pEGFP-C2-TUFT1的蛋白表達

2.4 TUFT1對胰腺癌細胞凋亡的影響

將胰腺癌細胞(Panc-1和BxPC-3)分成三組，即空白組、對照組和實驗組，空白組不轉染任何質粒，對照組轉染pEGFP-C2空載體質粒，實驗組轉染pEGFP-C2-TUFT1質粒，并用流式細胞術對各組細胞的凋亡情況進行檢測和比較，結果顯示空白組和對照組的細胞凋亡率分別為0.236±0.024/0.221±0.031和0.240±0.033/0.223±0.021，二者不存在統計學差異(P>0.05)，而觀察組的細胞增值率為0.095±0.008/0.091±0.009，均要顯著高于空白組和對照組(P<0.05)，表明TUFT1的過表達能夠顯著促進胰腺癌細胞(Panc-1和BxPC-3)的增殖，見表2。

表1 過表達TUFT1基因后對人胰腺癌細胞增殖的影響

* 表示與空白組和對照組相比，P<0.05。

表2 過表達TUFT1基因后對胰腺癌細胞凋亡的影響

* 表示與空白組和對照組相比，P<0.05。

3 討論

在21世紀，對胰腺癌的治療仍然是個難題，不但治愈率極低，而且預后效果也很差，患者中位生存期都很難超過6個月，5年生存率也基本低于5% ，但其發病率卻有逐年升高的趨勢，在有些國家和地區竟上升7倍之多，形勢異常嚴峻[8-9]。目前，對于胰腺癌發病的具體原因還不清楚，可能與吸煙酗酒、過分攝入高糖分、高脂肪、高熱量、高蛋白飲食等不良生活習慣、環境污染以及遺傳因素有著一定的關系[10]。對于PC的治療，主要采用以外科手術治療為主、放化療結合為輔、免疫和分子等生物治療綜合應用的治療方法，但由于其發病隱匿，大多數患者確診是已經失去了手術治療的機會，因此探索PC的發病機制、尋找治療其的有效的基因靶點意義重大。TUFT1是一種富含谷氨酸和天冬氨酸典型酸性蛋白，且其在脊椎動物中具有高度保守性，人類的和牛和小鼠的同源性分別高達89%和88%。最初的研究發現，TUFT1表達于牙齒中，在牙釉的發展和礦化中發揮著重要作用[11]，隨著研究的深入，發現TUFT1在其它組織中也有不同程度的表達[12-13]，尤其是癌組織，這將表明TUFT1可能與癌癥的發生發展密不可分。

癌細胞的遷移和轉移是癌癥惡化和致死的重要原因之一，而上皮細胞向間質細胞轉變(EMT)在這一過程扮演這十分重要的角色[14]，有研究表明TUFT1與胰腺癌細胞中EMT的發生有著密切的關系，過表達TUFT1后能夠顯著上調HIF1、Snail、Vimentin等蛋白的表達水平，同時降低E-cadherin的表達水平，而這些EMT相關蛋白的異常變化將最終導致胰腺癌細胞的遷移和遠處轉移，這一研究結果提示TUFT1可能發揮著一定的致癌功能，與癌癥的發生和發展有著密切的關系[7]。另外，細胞增殖和凋亡是一對相互并存的矛盾，二者的動態平衡維護這細胞的正常生長，而一旦這種平衡被打破，如細胞增殖的速度加快、細胞凋亡的速率下降最終會導致癌癥的發生[15]。因此為了確定TUFT1在癌細胞中的功能，本文進一步研究了TUFT1對胰腺癌細胞系(Panc-1, BxPC-3)增殖和凋亡的影響，我們首先成功構建了pEGFP-C2-TUFT1真核表達載體，然后瞬時轉染到Panc-1和BxPC-3細胞系中，裂解細胞提取總蛋白，免疫印跡檢測到該質粒能夠正常表達，為研究其在細胞增殖和凋亡中的功能奠定了基礎。在細胞增殖和凋亡的研究中，結果表明：TUFT1能夠促進胰腺癌細胞的增殖，并抑制癌細胞的凋亡，從而有利于癌細胞的遷移和轉移，但對于其促增殖抑凋亡的具體機制目前還不清楚，需要進一步研究。

綜上，本研究成功構建了人源TUFT1的真核表達載體，并初步確定TUFT1可以明顯加速人胰腺癌細胞株(Panc-1和BxPC-3)的增殖，同時又能抑制其凋亡，具有顯著的致癌功能，為進一步探索TUFT1基因功能、尋求治療胰腺癌的新途徑提供了細胞學基礎。另外本研究探討的是TUFT1過表達后對胰腺癌細胞的影響，在接下來研究中，我們將利用siRNA干擾技術和CRISPR技術沉默和敲除TUFT1基因，進而探討其對腺癌和其它癌細胞的增殖、凋亡、以及信號通路的影響，逐漸解開TUFT1基因與癌癥的關系。

[1]田碧.胰腺癌的治療現狀[J].腫瘤基礎與臨床，2014，27(1)：86-89.

[2]HX Zhan, JW Xu, D Wu, et al.Pancreatic Cancer Stem Cells: New Insight into a Stubborn Disease[J].Cancer Lett,2016(357):429-437.

[3]D Li, K Xie, R Wolff,et al. Pancreatic Cancer[J].Lancet, 2004(363):1049-1057.

[4]JM Winter, CJ Yeo, JR Brody. Diagnostic, Prognostic, and Predictive Biomarkers in Pancreatic Cancer[J].J Surg Oncol,2013(107):15-22.

[5]郭海濤，何光志.基因工程技術在醫學中的應用[J].北方藥學，2013(12)：54-56.

[6]D Deutsch, Y. Leiser, B Shay, et al.The Human Tuftelin Gene and the Expression of Tuftelin in Mineralizing and Nonmineralizing Tissues[J].Connective Tissue Research, 2002(43):425-434.

[7]Bin Zhou, Hanxiang Zhan,Lamtin Tin, at el. TUFT1 Regulates Metastasis of Pancreatic Cancer throughHIF1-SnailPathway Induced Epithelial-mesenchymal Transition[J].Cancer Letters,2016(1)：11-20.

[8]Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer Statistics[J].CA Cancer J Clin,2016,66(1):7-30.

[9]Long J,Luo GP,Xiao ZW,et a1.Cancer Statistics:Current Diagnosis and Treatment of Pancreatic Cancer in Shanghai,China[J].Cancer Lett,2014,346(2):273-277.

[10]楊興無.胰腺癌的流行病學和病因學機制[J].醫學與哲學(臨床決策論壇版)，2015(1)：10-11.

[11]Z Mao, B Shay, M Hekmati, et al.The Human Tuftelin Gene: Cloning and Characterization[J]. Gene, 2001(279):181-196.

[12]Deutsch D,Silverstein N,Shilo D,et al.Biphasic Influence of Hypoxia on Tuftelin Expression in Mouse Mesenchymal C3H10T1/2 Stem Cells[J].Eur J Oral Sci,2011,119(1):55-61.[13]Leiser Y,Silverstein N,Blumenfeld A,et al.The Induction of Tuftelin Expression in PC12 cell Line during Hypoxia and NGF-induced Differentiation[J].J Cell Physiol,2011,226(1):165-172.

[14]Diepenbruck M,Christofori G.Epithelial-mesenchymal Transition (EMT) and Metastasis: Yes, no, maybe?[J].Curr Opin Cell Biol,2016,29(43):7-13.

[15]Badisa RB, Darling-Reed SF, Joseph P, et al. Selective Cytotoxic Activities of Two Novel Synthetic Drugs on Human Breast Carcinoma MCF-7 cells[J].Anticancer Res.,2009(29):2993-2996.

Research on Construction of TUFT1 EukaryoticExpression Plasmid and Its Function

YUAN Kongxian1, WANG Jinian2

(1.DepartmentofPharmacy,TonglingPeople’sHospital,Tongling244002,China;2.DepartmentofEducation,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Extract total RNA of human hepatic stellate cells, reverse transcription into cDNA as templates, and obtain amplification TUFT1 CDS sequence, after connect to pEGFP-C2 carrier by using the double enzyme. Eukaryotic expression plasmid was transfected respectively to human pancreatic cancer cell line. Then, result showed that the cell proliferation rate of transfection group was significantly lower than normal group; cell apoptosis rate of transfection group was significantly higher than normal group. TUFT1 can significantly inhibit the proliferation of pancreatic cancer cell line, and promote its apoptosis. These results have a further understanding the function of TUFT1, and lay a foundation for searching a new direction in the therapy of pancreatic cancer.

TUFT1; transfection; proliferation; apoptosis

2017-03-27

袁孔現(1973-)，男，安徽當涂人，副主任藥師，研究方向：臨床藥學。通信作者：王繼年(1984-)，男，安徽阜陽人，助理研究員，碩士，研究方向：醫藥管理、藥理學。

R735.9

A

1009-9735(2017)02-0071-04