煙霧病患者外周血來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞體外培養(yǎng)的能力探討

張文高 趙志煌 李亞斌 尹港峰

煙霧病患者外周血來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞體外培養(yǎng)的能力探討

張文高 趙志煌 李亞斌 尹港峰

目的探討煙霧病患者外周血來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞體外培養(yǎng)的能力。方法收集近幾年我院因腦缺血或腦出血入院的煙霧病患者，定義為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為同期我院健康志愿者。結(jié)果（1）實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)第9 d、12 d增殖速率差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)第3 d、6 d、12 d、15 d增殖速率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。（2）實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組EPCs遷移細(xì)胞數(shù)（26．67±2．333）、（29．30±2．679），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。（3）實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組EPCs遷移細(xì)胞數(shù)（23．12±2．36）、（23．61±2．14），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05） 。結(jié)論本文推測(cè)煙霧病患者中，內(nèi)皮祖細(xì)胞與正常血管存在類似形態(tài)與增值、粘附、遷移功能。

煙霧病；內(nèi)皮祖細(xì)胞；體外培養(yǎng)

煙霧病是一類顱內(nèi)血管病變，表現(xiàn)為頸內(nèi)動(dòng)脈主干或大分支外徑減小，管壁膜增厚，呈“洋蔥皮狀”，導(dǎo)致前循環(huán)流量減低。眾多研究指出[1]煙霧病與眾多腦血管病存在共性：血管損傷與修復(fù)的失衡或異常導(dǎo)致出現(xiàn)相應(yīng)癥狀。1997年，國(guó)外學(xué)者體外分離出循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs），發(fā)現(xiàn)了新的血管內(nèi)皮損傷再修復(fù)的細(xì)胞來(lái)源[1]。還有學(xué)者[2]提出EPCs減少可增加動(dòng)脈粥樣硬化心血管事件發(fā)生。還有研究指出[2]煙霧狀腦缺血、腦出血患者增厚的血管內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)EPCs的持續(xù)增高。本文擬收集近幾年我院煙霧病患者，分析內(nèi)皮祖細(xì)胞在疾病中所扮演的角色，對(duì)揭示該疾病的發(fā)生過(guò)程提供思考。

1 資料與方法

1.1 資料

收集近幾年我院因腦缺血或腦出血入院的煙霧病患者14例，定義為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組為同期我院健康志愿者14例。實(shí)驗(yàn)組平均年齡（53.4±15.4）歲，其中男8例，女6例；對(duì)照組平均年齡（52.1±16.2）歲，其中男9例，女5例，兩組性別、年齡等對(duì)比，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

（1）入院后行全腦DSA檢查，診斷為煙霧病。（2）性別不限。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管炎者。（2）自身免疫系統(tǒng)疾病者。（3）心腦血管疾病者。

1.4 主要試劑盒設(shè)備

（1）主要試劑：Ficoll淋巴細(xì)胞分離液、M199培養(yǎng)液、胎牛血清、VEGF、bFGF、D-Hank's平衡液、纖維連接蛋白、CCK-8試劑盒等。（2）主要設(shè)備：CO2培養(yǎng)箱、工作臺(tái)、低溫離心機(jī)、超純水裝置、顯微鏡、低溫冰箱等。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法與觀察指標(biāo)

（1）循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，單個(gè)核細(xì)胞初步培養(yǎng)和EPCs方向誘導(dǎo)分化。（2）細(xì)胞熒光鑒定。（3）細(xì)胞的活動(dòng)性鑒定：細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞遷移能力、細(xì)胞粘附能力測(cè)定。

1.6 觀察指標(biāo)

對(duì)比不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)兩組EPCs吸光度，以及兩組細(xì)胞遷移能力及粘附能力。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)兩組EPCs吸光度

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)第9 d、12 d增殖速率對(duì)比，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)第3 d、6 d、12 d、15 d增殖速率對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.2 兩組細(xì)胞遷移能力對(duì)比

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組EPCs遷移細(xì)胞數(shù)（26.670±2.333）、（29.300± 2.679），兩者遷移能力相似（P＞0.05）。

2.3 兩組細(xì)胞粘附能力對(duì)比

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組EPCs遷移細(xì)胞數(shù)（23.12±2.36）、（23.61± 2.14），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

煙霧病為醫(yī)囑顱內(nèi)血管病變，血管狹窄或閉塞，致前循環(huán)血量減低，可有腦缺血、腦出血等癥狀[3]。國(guó)外學(xué)者在1969年首次提出“煙霧狀血管”的命名，其發(fā)生機(jī)制受到廣泛的研究[4]。

3.1 血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為

以往觀念認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞是不穩(wěn)定細(xì)胞，參與血管內(nèi)皮損傷后得修復(fù)。1997年國(guó)外學(xué)者通過(guò)磁珠標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)表達(dá)CD133亞型循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞，骨髓動(dòng)員后分化成為血管內(nèi)皮細(xì)胞[5]。

煙霧病與動(dòng)脈粥樣硬化、先天性顱內(nèi)血管改變 、動(dòng)脈瘤破裂、免疫介導(dǎo)炎性改變有眾多相同點(diǎn)。有學(xué)者[6]對(duì)1名73歲煙霧 血管患者Willis環(huán)狹窄處大動(dòng)脈進(jìn)行病理解剖，管壁內(nèi)膜增厚約為正常血管2～3倍，彈力層結(jié)構(gòu)斷裂，內(nèi)膜增厚呈洋蔥狀，狹窄動(dòng)脈增厚的內(nèi)膜可見(jiàn)原位于中膜的合體平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移增生，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞、鈣化。內(nèi)皮細(xì)胞參與血管生成、組織灌注、免疫、凝血等功能[6-7]。

3.2 成人煙霧病患者培養(yǎng)出與健康人相近功能的內(nèi)皮祖細(xì)胞

研究指出，煙霧病存在血管閉塞、腦組織缺血等現(xiàn)象，同時(shí)內(nèi)皮祖細(xì)胞存在升高，并誘導(dǎo)新生血管生成有關(guān)。有學(xué)者通過(guò)病理解剖，發(fā)現(xiàn)VEGFR-2陽(yáng)性細(xì)胞在閉塞動(dòng)脈處聚集。還有研究指出腦梗塞與腦出血的風(fēng)險(xiǎn)與內(nèi)皮祖細(xì)胞增高存在正相關(guān)。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)第3 d、6 d、12 d、15 d增殖速率對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），同時(shí)兩組細(xì)胞遷移能力、粘附能力基本類似。我們推測(cè)煙霧病患者中，內(nèi)皮祖細(xì)胞與正常血管存在類似形態(tài)與增殖、粘附、遷移功能。

[1] 馮雨，陳勁草，于加省，等． 手術(shù)治療降低煙霧病腦出血發(fā)生率的研究[D]． 湖北：華中科技大學(xué)，2010：58-59．

[2] 陳勁草，劉斌，李正偉，等． CT灌注成像對(duì)煙霧病行腦血管重建術(shù)的療效評(píng)價(jià)[J]． 中華神經(jīng)外科雜志，2009，25（6）：537-540．

[3] 李正偉，陳勁草，于加省，等． 煙霧病行STA-MCA分流術(shù)前后腦血流的TCD檢測(cè)[J]． 中國(guó)臨床神經(jīng)外科雜志，2009，14（7）：397-400．

[4] 李柏，王忠誠(chéng)，孫異臨，等． Moyamoya病腦血管的超微形態(tài)學(xué)研究[J]． 中華神經(jīng)外科雜志，1987，3（2）： 14．

[5] 陳勁草，周平，歐一博，等． 聯(lián)合血管重建術(shù)治療煙霧病療效分析[J]． 中國(guó)臨床神經(jīng)外科雜志，2011，16（10）： 581-583．

[6] 耿萬(wàn)杰, 李正俠． 單側(cè)煙霧病臨床特點(diǎn)的分析[J]． 臨床薈萃, 2012, 27（1）：520-522

[7] 李德生, 咸鵬, 楊偉中, 等． 單側(cè)煙霧病的臨床特征[J]．中國(guó)卒中雜志, 2013, 8（5）：511-516

Study the Ability of Endothelial Progenitor Cells From Peripheral Blood in Patients With Smoke Disease

ZHANG Wengao ZHAO Zhihuang LI Yabin YIN Gangfeng The Third Department of Neurosurgery , Cangzhou Central Hospital, Cangzhou Hebei 161001, China

ObjectiveTo investigate the ability of peripheral blood derived endothelial progenitor cells from peripheral blood in patients with smoke disease.MethodsIn recent years, patients with cerebral ischemia or cerebral hemorrhage admitted to hospital were defined as experimental group. Control group for the same period in our hospital healthy volunteers.Results(1) experimental group and control group were cultured for ninth days and 12 days. The proliferation rate was different (P＜0.05). The proliferation rate of the experimental group and the control group was 3 days, 6 days, 12 days and 15 days. (2)there was no differernt in the number of migrating cells in the experimental group and the control group was (26.67 ±2.333), (29.30 ± 2.679), and the migration ability was similar (P＞0.05). (3) there was no differernt in the number of migrating cells in the experimental group and the control group was (23.12 ± 2.36), (23.61 ± 2.14) (P＞0.05).ConclusionIn this paper, we hypothesized that endothelial progenitor cells and normal vascular endothelial progenitor cells have similar morphology and proliferation, adhesion and migration.

smoke disease;endothelial progenitor cells;vitro culture

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)兩組EPCs吸光度

R743

A

1674-9316（2017）01-0144-02

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．01．093

滄州市中心醫(yī)院神經(jīng)外三科，河北 滄州 161001