一例豬藍耳病的實驗室診斷及NSP2、ORF5基因序列分析

李原野，李鳳琴＊，徐志文，朱 玲

(1.西昌學院動物科學院，四川 西昌 615000，2.四川農業大學動物醫學院，四川 成都 611130）

一例豬藍耳病的實驗室診斷及NSP2、ORF5基因序列分析

李原野1，李鳳琴1＊，徐志文2，朱 玲2

(1.西昌學院動物科學院，四川 西昌 615000，2.四川農業大學動物醫學院，四川 成都 611130）

為診斷四川眉山某豬場暴發的疑似豬藍耳病。利用RT-PCR方法對其進行分子診斷，在確認為陽性結果的基礎上針對PRRSV的ORF5和Nsp2基因分別設計特異性引物，擴增基因片段進行測序然后對其進行遺傳進化分析。結果表明，該疫情由PRRSV引起，遺傳進化分析表明該PPRSV毒株的ORF5和Nsp2無明顯變異，現有防控措施有效。

豬繁殖與呼吸綜合征；ORF5；Nsp2；RT-PCR診斷

豬藍耳病亦稱豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的豬繁殖障礙和呼吸道傳染病，臨床主要表現為妊娠母豬繁殖障礙，妊娠母豬流產、弱胎、死胎、木乃伊胎[1]；仔豬主要表現為間質性肺炎等癥狀[2]。本病于20世紀80年代在美國首次流行以來，迅速傳遍世界主要養豬國家，中國于1995年發現該病[3]，是威脅我國當前養豬業持續健康發展的主要疫病之一，加強該病的分析研究和綜合防控，對生豬生產穩定發展意義重大。2016年12月，四川眉山某豬場暴發疑似豬繁殖與呼吸綜合征疫情，發病豬呼吸困難，剖檢肺部病變明顯，送至四川農業大學動物生物技術中心進行實驗室檢測。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品采集

2016年12月，四川眉山某豬場發生疑似PRRS，主要表現為仔豬食欲減退、高熱，體溫41 ℃，輕微腹瀉以及嚴重的呼吸道癥狀，剖檢可見肺部間質性肺炎，全身淋巴結輕度水腫。通過臨床特征和病理解剖初步判斷為PRRS。采集發病豬血清以及肺臟、淋巴結和脾臟等組織冷藏保存，送實驗室進行PRRSV的RT-PCR診斷。

1.2 主要儀器和材料

Mastercycler PCR 擴增儀（Eppendorf，德國）、Gel Doc 2000 凝膠圖像分析系統（BIO-RAD，美國）、2×Taq Plus PCR MasterMix（含染料）購自天根生化科技（北京）有限公司，反轉錄試劑盒、TakaRaTaqDNA酶和DL 2 000 DNA Marker（寶生物工程大連有限公司）。

1.3 引物設計與合成

本實驗所使用引物如表1所示，所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR檢測及基因組序列擴增所使用引物

1.4 病料處理及RNA的抽提

取采集病料0．5～2．0 g 研磨，并按1∶3 比例加入生理鹽水配成病料懸液，隨后反復凍融3次。凍融后按12 000 r/min 離心5 min 后取上清液，按照Trizol法提取RNA，并將提取的RNA按照反轉錄試劑盒方法制成cDNA保存備用。

1.5 RT-PCR檢測

取1μL cDNA于PCR管中，然后分別加入引物P1、P2和P3各10 pmol，2×PCR Master Mix 25μL，并補加無菌水至50μL，混勻后置PCR儀中按照以下程序進行擴增：95 ℃，1 min；95 ℃，5 s，57 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，40個循環；72 ℃ 1 min； PCR結束后取5μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。

1.6 Nsp2和ORF5基因擴增

以1．5反轉錄的cDNA為模板，分別加入Nsp2-1、Nsp2-2引物和ORF5-1、ORF5-2引物，2×PCR Master Mix 25μL，并補加無菌水至50μL，擴增Nsp2高變區和ORF5基因。

1.7 克隆與鑒定

PCR擴增結束后用1%瓊脂糖凝膠電泳、電壓100 V、30～50 min后觀察結果，按照膠回收試劑盒說明書回收目的基因片段，與pMD19-T Simple Vector載體連接，轉化DH5α感受態細胞，挑取白色菌落，接種于LB液體培養基（Amp+）中培養后提取質粒，經NcoI、BamH I雙酶切及PCR鑒定，陽性菌液保存備用。

1.8 序列測定及分析

將含目的DNA的陽性菌液送至寶生物工程（大連）有限公司進行測序。采用DNAStar軟件（Version 7．0）對Nsp2基因、ORF5基因序列與GenBank中收錄的PRRSV的Nsp2基因、ORF5 基因序列的核苷酸及氨基酸序列進行同源性分析，應用ClustalX、Mega 4．1 軟件繪制進化樹。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR檢測結果

凝膠電泳檢測，發現待檢測樣品擴增出一條180 bp的目的條帶（如圖1），而陰性對照樣品沒擴增出條帶，此次發病豬為HP-PRRSV毒株感染。

2.2 Nsp2和ORF5基因片段的擴增

圖1 病料檢測結果

Nsp2和ORF5基因擴增凝膠電泳結果顯示Nsp2擴增出一條約為1 100 bp大小的片段（如圖2A），而ORF5擴增出一條約為564 bp大小的片段（如圖2B）。

2.3 序列測定結果

將連接質粒測序后對序列進行拼接，將此次測序毒株命名為PRRSV SC-2016株。結果顯示，Nsp2高變區序列長度為1 103 bp，ORF5序列長度為563 bp。分別將其與GenBank中收錄的PRRSV毒株相應序列進行Blast比對。通過臨近結合法（Neighbor-joining，NJ）分別構建SC-2016毒株及參考毒株的Nsp2和 ORF5遺傳進化樹，并且從遺傳進化樹分支來看，SC-2016株屬Hp-PRRSV亞型。

2.4 SC-2016毒株的Nsp2、ORF5基因序列分析

系列分析結果表明：SC-2016毒株的Nsp2與GenBank中14種參考毒株的同源性在68．0%-83．1%之間（見圖3），其中與北京株（2007-EU106888．1）、甘肅株（2006-EU236259．1）、廣東株（2007-EU880433．2）、甘肅株（2008-EU880437．2）、北京株（2006-EF112445．1）、武漢株（2013-HM853673．2）、河北株（2012-JQ326271．1）的同源性在82．0%～83．1%之間。與北京株（2006-EF112445．1）、甘肅株（2006-EU236259．1）、甘肅株（2008-EU880437．2）、河北株（2012-JQ326271．1）的同源性最高，達82．9%～83．1%。

SC-2016毒株ORF5與GenBank中14種參考毒株的同源性在87．9%～99．8%之間（見圖4），其中與北京株（2007-EU106888．1）、甘肅株（2006-EU236259．1）、廣東株（2007-EU880433．2）、甘肅株（2008-EU880437．2）、武漢株（2013-HM853673．2）、河北株（2012-JQ326271．1）、北京株（2006-EF112445．1）的同源性均在98%以上。與武漢株（2013-HM853673．2）、河北株（2012-JQ326271．1）的同源性最高，達99．7%～99．8%。

2.5 SC-2016毒株的Nsp2、ORF5基因遺傳發育樹分析

SC-2016毒株的的Nsp2和GenBank中收錄的14種代表毒株ORF5基因序列繪制系統發生樹，通過比較發現與北京株（2006-EF112445．1）、甘肅株（2006-EU236259．1）、河北株（2012-JQ326271．1）關系較近（見圖5）。

圖4 ORF5基因同源性分析矩陣圖

圖5 Nsp2基因遺傳進化樹

圖6 ORF5基因遺傳進化樹

SC-2016毒株的ORF5和GenBank中收錄的14種代表毒株ORF5基因序列繪制系統發生樹，通過比較發現與河北毒株（2012-JQ326271．1）關系較近（見圖6）。

3 討論與分析

PRRS在20世紀80年代暴發以來，目前已成為危害世界養豬業的主要疫病之一，給整個養豬業造成嚴重的經濟損失。主要引起母豬流產、早產、死胎，斷奶仔豬生長遲緩，且常常繼發其他病原感染。目前世界各國都在積極采取多種預防措施，但是該病在世界范圍內仍陸續暴發，甚至出現了更多的高致病毒株系，PRRSV不同分離株核苷酸序列存在廣泛而明顯的變異，而不同毒株的 PRRSV具有不同的抗原性，從而造成本病更加難以控制[4-5]。PRRSV感染豬群后，其發病臨床特征和嚴重程度，取決于毒株、豬的年齡、繼發其他細菌或病毒的感染情況。PRRSV毒株的毒力越強、感染豬的日齡越小、存在其他病原混合感染時，臨床出現的病征就越嚴重，本場此次發生的PRRS疫情表現為發病豬臨床病征較嚴重，鑒定結果表明此次感染毒株為高致病性藍耳病毒株。

據資料表明，PRRSV通過堿基突變、缺失和基因重組發生變異，其中堿基突變最為多見[6]。高志強[7]等在2002年對HB-2(sh)毒株的全基因序列測定分析時首次發現PRRSV存在缺失變異現象，在NSP2和GP3基因上分別存在連續12個和1個氨基酸基因的缺失。越來越多的研究表明，PRRSV不同毒株的變異在整個基因組均有發生，但以Nsp2、ORF5變異程度最大[8-9]。因此，很多學者根據ORF5基因的變異情況研究病毒的遺傳演化規律。在所有結構蛋白中，Nsp2為各毒株間差異較大的一個編碼區，變異程度最高，并具有種特異性，在各毒株間存在較大的差異，這也為主要毒株的新的分類方法提供了依據。此次對PRRS SC-2016毒株分別將其與GenBank中收錄的PRRSV毒株相應序列進行Blast比對。并對SC-2016毒株及參考毒株分別構建了Nsp2和ORF5的遺傳進化樹。

根據遺傳分析結果可知，PRRSVSC-2016株的ORF5基因和Nsp2基因與2012年分離的河北毒株的親緣關系最近。從遺傳進化樹分支來看，SC-2016株分屬Hp-PRRSV亞型，基因分析表明四川眉山株的PRRSV病毒的變異度不大，在其生物學特性以及細胞嗜性、致病力等方面變化都不大。同時通過進化分析也發現，該病毒的序列略有變異，在日常防控工作中仍需加強PRRSV的監測，做好該病的分子生物學調查，分析研究該病原變異的趨勢，對其致病機理和免疫機理進行深入研究分析，更加有效的根據變異提供有效的疫苗，以更好的防控該病。

[1] 閆軍霞，畢孝瑞．豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2的研究進展[J]．中國獸醫雜志，2013，49(6)：56-58．

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2017-03-09)

四川省科技支撐計劃（2014NZ0043），國家“十二五”科技支撐計劃（2015BAD12B04-2.3）

李原野（1993-），女，四川人，在讀碩士研究生，主要從事動物傳染病病原分子生物學方向的研究

*通訊作者：李鳳琴，Tel：0835-2885846， E-mail： 410726908@ qq.com