臨床級臍帶間充質細胞制備及鑒定方法研究

袁艷鵬 王淑艷 唐璽和 劉仲鳳 張愚 陳志國

臨床級臍帶間充質細胞制備及鑒定方法研究

袁艷鵬 王淑艷 唐璽和 劉仲鳳 張愚 陳志國

目的 在GLP實驗室中制備并鑒定臨床級臍帶間充質細胞（UC-MSC）。方法 新鮮獲取的臍帶去除血管并進行充分清洗，獲得的華通膠（Wharton’s jelly）機械分離后分別進行直接貼壁法和不同的酶消化法，比較獲取UC-MSC的數量差別；用不同的無血清培養基進行培養比較細胞形態是否良好，得到最佳形態的UC-MSC。體外培養第3代后進行UCMSC質檢，包括細胞活性，生長曲線，無菌檢測，人類相關病毒、支原體、內毒素檢測，染色體核型分析，FACS免疫表型檢測及分化能力檢測。不同消化方法獲取細胞數之間比較采用兩樣本配對t檢驗。結果 膠原酶Ⅱ消化獲得的UC-MSC數（5.3×106±0.58個/ml）與膠原酶Ⅰ+ 0.25﹪胰酶消化法（2.53×105±0.03個/ml）及直接貼壁法（2.6×105±0.05個/ml）之間差異有統計學意義（P ＜ 0.05），與膠原酶Ⅰ消化法獲取細胞數（5.1×106±0.57個/ml）之間差異無統計學意義（P = 0.07），但培養視野最干凈；MesenCult-ACF Medium培養獲得的UC-MSC形態最佳；UC-MSC質檢細胞活性凍存前達99.8﹪，凍存復蘇后達99﹪；無細菌、支原體、乙肝病毒、丙肝病毒、梅毒螺旋體、艾滋病毒、肺炎支原體、EB病毒、巨細胞病毒污染；內毒素檢測結果均＜ 1 EU；CD73/CD90/CD105陽性率達98﹪，CD34/CD45/HLA-DR呈陰性，陽性率＜ 2﹪；染色體核型分析無突變或缺失；UC-MSC具有成脂、成骨或成軟骨方向分化的能力。結論 通過優化分離和培養條件，采用無血清及無動物來源的培養系統，在GLP實驗室內可獲得臨床級UC-MSC。

臍帶； 間質細胞； 膠原酶類； 培養基、無血清； 細胞分化

間充質干細胞（mesenchymal stromal cells，MSCs）最早從骨髓中發現[1]，隨著MSCs的廣泛應用，逐漸在多種組織中也發現了MSCs，包括脂肪、胎盤、臍帶、臍血、羊膜及肌肉等[2]。……