微藻基因工程概述*

閆晉飛 楊玉瑩 馬淑霞

（1國家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所 天津 300192 2沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院 遼寧沈陽 110016）

微藻是一種單細胞真核生物，是地球上出現最早的物種之一，廣泛分布于海洋、淡水湖泊等水域。全球已鑒定的微藻種類達2萬余種。微藻豐富的代謝產物中，包含其代謝特有的一些種類的多糖、多不飽和脂肪酸（PUFAs）、生物活性肽、蛋白質、抗氧化劑、免疫活性因子等。這些代謝產物在食品、醫藥、科研、能源等行業具有重要應用價值。因此，如何通過遺傳轉化和基因編輯技術修飾微藻基因和引入外源基因，從而提高微藻相關代謝產物的產量，成為國內外學者競相研究的熱點。

隨著二代測序成本的降低，一些藻類基因組先后被公布，這為針對微藻的遺傳學改造提供了更加清晰的背景，一定程度上推動了微藻基因工程技術的發展。本文將對現今應用于微藻的遺傳介導體系及基因編輯技術進行簡單總結。

1 真核微藻常用的遺傳介導轉化方法

細胞核、線粒體和葉綠體是微藻細胞內主要存在的3套遺傳體系。基于微藻細胞器膜及其線粒體和葉綠體的存在，可選用基因槍法將外源目的基因導入其線粒體和葉綠體中并實現瞬時表達。將外源基因導入微藻細胞核中的常用方法有：

1.1 玻璃珠法 玻璃珠法（glass beads method），又叫 PEG（聚乙二醇）法，由于聚乙二醇能強烈刺激原生質體吸收 DNA、RNA等大分子物質，因此將玻璃珠、聚乙二醇、外源基因加入微藻細胞中，在一定條件下混合攪拌，可轉入外源基因。該法成本低，轉化率高，操作簡單易行，但具有一定的宿主局限性，目前僅能用于衣藻［1］和杜氏鹽藻等缺壁的藻株中，尚未廣泛應用。

1.2 碳化硅細絲轉化法 碳化硅細絲轉化法（silicon carbide whiskers），也叫金剛砂法，最早在1993年應用于萊茵衣藻［2］的轉化，該法與玻璃珠法類似，不同之處在于它使用碳化硅細絲代替玻璃珠。由于碳化硅細絲的使用，藻株可以不用去除細胞壁，其宿主范圍變廣，但是碳化硅細絲價格較高且不易購買，因而也未能得到廣泛使用。

1.3 電擊法 電擊法（electroporation），也稱電穿孔法，是利用高壓使細胞膜通透性瞬間增大，細胞吸收周圍外源基因，從而實現基因導入的一種方法。電擊法操作較簡單，有較為標準的實驗流程，不足之處是耗材成本相對較高。目前此方法被大多數實驗室所采用，主要用于酵母和裂壺藻等相對細胞壁較厚、個體相對較小的真核微生物轉化中，此外，在綠藻門、硅藻門［3］、褐藻門及紅藻門［4］的一些種屬均有應用電擊法的報道。

1.4 粒子轟擊法 粒子轟擊法（particle bombardment），也叫基因槍法，是指在真空條件下，用外源DNA包裹金屬顆粒（金粒或鎢粒），利用基因槍裝置產生的高壓氦氣沖擊波加速微彈，使其直接穿透細胞壁和細胞膜，從而使外源DNA進入細胞并整合到細胞染色體中，最終實現穩定遺傳和表達的目的。該方法對靶細胞來源基本無限制，應用面較廣，操作簡單，轉化時間短、頻率高；其缺點是需要專門的實驗設備，實驗耗材成本是以上所提到的轉化方法中最高的。現主要應用于水稻、擬南芥等高等植物的瞬時轉化驗證實驗中，在微藻中，已成功應用該技術的有萊茵衣藻、小球藻［5］、團藻、三角褐指藻、雨生紅球藻［6］等。

1.5 農桿菌轉化法 農桿菌轉化法（Agrobacteriummediated transformation）通常用于高等植物細胞中。某些農桿菌的細胞含有 Ti（Tumour inducing）質粒或Ri（Root inducing）質粒，其上有一段T-DNA（Transferring DNA），農桿菌侵染植物組織后進入靶細胞，可將T-DNA整合入靶細胞基因組中，并通過減數分裂穩定遺傳給后代。隨著農桿菌轉化法的改進與推廣，科學家嘗試將其用于微藻轉化。Kumar等［7］首先成功地用該方法轉化萊茵衣藻，獲得了較高的轉化效率，證實了該方法應用于微藻轉化的可行性。此后，各國學者嘗試將其用于一系列其他微藻中，例如淡水的雨生紅球藻、普通小球藻［8］、斜生柵藻及海水藻如紫菜、杜氏鹽藻［9］、裂壺藻等，取得了一定效果。農桿菌轉化法成本低廉，效率較高，但該方法在如何制備不同藻類的原生質體、確定農桿菌與目標藻體的比例、共培養時長等問題上存在挑戰，不同藻類的操作流程不盡相同，需進行實驗探索，一定程度上限制了其普及。

此外，病毒的轉染也是將外源基因導入細胞的一種方法，此法主要用于人及哺乳類動物細胞的基因改造，但用此法對微藻進行外源基因的轉化未見報道，這可能是由于目前對微藻的研究尤其是遺傳背景研究等方面不全所致。

2 發展中的基因編輯系統

基因編輯是對基因組中靶DNA序列精確修改的一種技術，在后基因組時代，已成為研究微藻基因功能最直接有效的方法之一。目前微藻基因功能的研究主要依賴于基因敲除和外源基因表達技術，從失去功能和獲得功能正、反2個方面解析基因功能。近年來，基因編輯技術不斷發展，從傳統的基因插入突變和 RNA干擾技術，發展到一些新興的序列特異性核酸酶技術都能一定程度上有效地編輯基因。

2.1 傳統基因敲除方法 研究人員應用傳統基因敲除方法對部分微藻進行靶向DNA修飾。主要有以下3種技術:隨機插入突變、同源重組和RNA干擾。

2.1.1 隨機插入突變 理論上，大規模的隨機插入突變可在基因組內敲除任一基因。因而，利用逆轉錄病毒、農桿菌等介導，在靶細胞的基因組中隨機插入目的基因，建立一個攜帶隨機插入突變的細胞庫，然后通過相應的標記篩選以獲得所需要的基因敲除細胞。基于隨機插入突變的基因捕獲技術有效率高、能使靶基因完全失活且容易分離鑒定的優點。利用該法進行基因敲除所用的載體和方法隨受體的不同有所不同：逆轉錄病毒一般用于動、植物細胞，農桿菌介導的 T-DNA轉化和轉座子法常用于植物細胞，噬菌體主要用于細菌，基因槍法可用于微藻例如三角褐指藻［10］突變體文庫的構建。目前，受微藻自身生物學特性和遺傳特性的影響，加之插入標簽載體會在很大程度上影響研究的進程與結果，微藻隨機插入突變的研究主要局限于少數模式微藻。

2.1.2 同源重組技術 利用同源重組（homologous recombination，HR）原理進行基因敲除，即構建含有目的基因和靶基因同源片段的重組載體，將其導入靶細胞內，通過同源序列間的重組交換，將外源目的基因整合進受體基因組的目標位置上，以敲除靶基因，并表達外源目的基因，通過研究外源目的基因插入前、后生物體或靶細胞遺傳特性的改變研究基因功能。

基于HR的基因敲除技術分為完全型基因敲除和條件型基因敲除。完全型基因敲除指利用HR原理完全消除細胞或動物個體中的靶基因活性；條件型基因敲除是指將基因的修飾限制在細胞發育的特定階段或某種特定細胞的基因敲除，應用較廣泛的條件型基因敲除系統有Cre/Lox系統［11］、FLP/FRT系統。目前微藻研究中完全型基因敲除應用最為廣泛，條件型基因敲除應用鮮見報道。

2.1.3 RNA干擾技術 RNA干擾（RNA interference,RNAi）是轉錄后水平的基因沉默機制,是siRNA（small interfering RNA，長 20～25 bp的雙股 RNA）分子在mRNA水平上誘發的同源mRNA高效特異性降解的現象，于1998年由Fire首次發現并命名。該方法將短片段的siRNA分子導入細胞內，特異性地降解細胞內與其同源的mRNA，從而阻斷特定基因的表達，以達到干擾靶基因表達的目的。RNAi操作簡單，成本低，效率高，特異性強，穩定性高，應用較廣泛。但由于siRNA不能有效結合所有基因的mRNA，將靶基因全部剔除，只是降低基因的表達水平，產生不完全敲除且具有臨時性等，應用受到限制。RNAi技術作為基因敲除的一種重要方法，在動、植物研究中應用廣泛，在微藻中的應用常見于萊茵衣藻［12］。

2.2 新興的基因編輯技術 序列特異性核酸酶（sequence-specific nucleases，SSN）技術通過引入SSN在基因組特定位點造成DNA雙鏈斷裂，從而激活細胞天然的“同源重組”及“非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）”DNA 修復機制的定向發生，實現基因組定向遺傳修飾效率的大幅提升。迄今為止，在基因組定向遺傳修飾研究及應用領域，已經有多種不同類型的序列特異性核酸酶被有效使用［13］。下面代表性地介紹幾種在微藻中具有應用潛力的SSN技術。

2.2.1 鋅指核酸酶基因打靶技術 鋅指核酸酶（zinc-finger nuclease，ZFNs）是一種人工合成的限制性內切酶，其核心設計理念是將2個具有特定功能的結構域，特異性識別DNA序列的鋅指結構域和非特異核酸內切酶活性的DNA切割域，即特異性識別模塊與功能模塊之間相互融合，形成具有特定基因編輯功能的蛋白。

圖1 ZFNs技術示意圖［14］

鋅指核酸酶N末端是鋅指蛋白DNA的結合域，由一系列 Cys2-His2鋅指蛋白（zinc-fingers，ZF）串聯組成（一般 3～4個），每個鋅指可特異識別并結合DNA鏈上的3個連續堿基；C末端多為非特異性FokⅠ核酸酶結構域，FokⅠ是一種type IIS型的核酸內切酶，源于限制性內切酶FokⅠ的一個亞基，二聚化后才具有切割活性。實際應用時，通常針對靶序列設計一對ZFNs，并在靶序列之間留有5～7 bp的間隔區域（spacer）以確保一對ZFN中FokⅠ二聚體的形成［13］。FokⅠ二聚體化后產生酶切功能，并在此特異位點產生1個DNA雙鏈切口（double strands breaks，DSB），細胞通過 NHEJ機制修復DSB。在修復重連過程中，堿基隨機的插入或丟失造成移碼突變，使基因無法正常表達，實現基因敲除；當存在含有同源序列的重組供體時，發生HR修復，則實現外源基因的定點敲入。

2013 年，Sizova 等［15］首次將 ZFNs技術應用于萊茵衣藻，從而實現了高效率的基因定點修飾。以ZFNs為介導的基因敲除技術可精確修飾靶基因或其周圍的調控元件，但也存在應用上的難題：1）如何設計、篩選具有高親和性及高特異性的鋅指蛋白酶；2）ZFN可能會對基因組非靶向位點隨機切割，損傷細胞；3）如何有效調控ZFNs的表達等。

2.2.2 TALENs技術 轉錄激活因子樣效應物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALENs）靶向基因敲除技術，其設計和構建的原理是植物病原體黃單胞菌（Xanthomonas）分泌的一種轉錄激活子樣效應因子（transcription activator－like effector，TALE）可以識別特定的DNA序列。

與 ZFNs相類似，TALENs主要包括 2個組成部分：DNA識別域（TALE蛋白）和剪切結構域（FokⅠ核酸內切酶）。TALE蛋白（如圖 2A）由17～18個特異性識別DNA的串聯重復基本單元構成，每個串聯重復基本單元由34個氨基酸殘基構成，其中第12和13位殘基是靶向識別的關鍵位點，稱作重復可變氨基酸殘基位點（repeat variant diresidues，RVDs），不同 RVDs組合能特異識別一個堿 基 （HD →C、NI→A、NG →T、NN →G、MN →G或A）。利用TALE這種識別單元與核苷酸堿基恒定的對應關系，實際操作中可通過靶位點的DNA序列反推二聯氨基酸序列構建TALE靶點識別模塊。目前TALENs的構建中最常用的是Cermak等發表的“Golden Gate”，與其類似的構建方法都遵循該思路：將4種堿基對應的TALE模塊的DNA序列連接到載體上，然后通過酶切連接將各TALE單體組成陣列，最后與N端的核定位信號（nuclear localization signal，NLS）及 C 端的 FokⅠ核酸酶連接起來，完成 TALENs 表達質粒的構建［16］。 TALENs質粒共轉入細胞后，其表達的融合蛋白在NLS幫助下由細胞質進入細胞核,分別找到其靶基因位點并與靶位點特異結合。此時，2個TALENs融合蛋白中的FokⅠ功能域形成二聚體并發揮非特異性內切酶活性，于2個靶位點之間剪切目的基因，產生1個DSB。由此，可以在該位點進行敲入（knock-in）、敲出（knock-out）或點突變等操作。

圖2 TALENs技術示意圖［17］

TALENs作為新興的基因定點編輯工具，近幾年已成功應用于動、植物和酵母［17］等微生物細胞，在微藻的萊茵衣藻［18］及三角褐指藻［19］中也已得到運用。它成功解決了ZFNs技術識別目標基因序列方面的低特異性及易受上、下游序列影響等問題，同時具有與其相等甚至更好的活性，無基因序列、細胞、物種限制，載體構建簡單易行，成本低，脫靶率小，細胞毒性小。目前 TALENs技術的不足之處主要在于2個方面：1）設計識別僅20個堿基序列的 TALE核酸酶可能含有1 000多個氨基酸，分子量過大易引起細胞免疫反應，減弱TALE在細胞中的作用；2）與ZFNs相比，脫靶問題雖然得到了一定控制但依然存在。

2.2.3 CRISPR/Cas系統 2013年以來，研究人員在包括Science和Nature Biotechnology等著名雜志上發表多篇文章介紹CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats） /Cas（CRISPR-associated）系統。天然的CRISPR/Cas系統廣泛存在于細菌及古生菌中，是機體長期進化形成的RNA指導的降解入侵病毒、噬菌體DNA的適應性免疫系統。Cas基因家族編碼的蛋白具有與核酸結合及核酸酶、聚合酶、解旋酶等活性，根據其基因核心元件序列的不同［20］，CRISPR/Cas免疫系統可分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型3種類型。其中，Ⅰ型和Ⅲ型的CRISPR/Cas免疫系統需要多種Cas蛋白形成復合體才能切割DNA雙鏈，而Ⅱ型CRISPR/Cas免疫系統只需要1個Cas9蛋白即可切割DNA雙鏈。

CRISPR/Cas9是目前研究最為充分的系統，其主要工作結構包括Cas9蛋白、crRNA、tracrRNA 3個部分。Cas9是由1 409個氨基酸組成的多結構域蛋白,含有2個核酸酶結構域：位于蛋白中間位置的HNH核酸酶結構域及氨基端的RuvC-like結構域。當外源DNA入侵細胞，crRNA經RNaseⅢ催化和tracrRNA形成雙鏈RNA結構介導Cas9蛋白定向切割與crRNA互補的靶序列位點［16］。研究發現，將crRNA與tracrRNA結合設計形成一條單鏈RNA（single guide RNA,sgRNA）同樣也能指導Cas9蛋白切割雙鏈DNA，這樣進一步提高了操作的簡便性。如圖3所示，在sgRNA的指導下，Cas9蛋白HNH核酸酶結構域剪切與sgRNA互補配對的模板鏈，RuvC-like結構域可以對另一條鏈進行切割，從而形成DSB。其中切割位點位于原型間隔序列毗鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM）上游 3～8 nt處。

圖3 CRISPR/Cas9識別目標基因組DNA示意圖［21］

目前，CRISPR/Cas9靶向基因改造（敲入、敲出）技術已經成功應用于擬南芥、煙草、小鼠、斑馬魚、酵母等模式生物基因組的遺傳學改造上。但該技術在微藻中的應用目前僅可見于萊茵衣藻［22］。與ZFNs及TALENs基因定點改造技術相比，CRISPR/Cas9系統具有顯著優點：無基因序列、細胞、物種限制；可以對所有后面緊隨 NGG（PAM）的 20 bp的基因序列進行編輯，理論上在基因組上8 bp就有一個適合CRISPR/Cas9編輯的位點，而對于ZFNs和TALENs分別需要500 bp和125 bp才會有合適的編輯位點［23—24］；可同時作用于多個靶位點；載體構建簡單且Cas9基因相同，針對特定物種特定基因位點只需找到該物種對應的高效啟動子及設計識別靶基因的sgRNA，實驗周期短、成本低，而ZFNs或TALENs對任一基因位點編輯時都需要設計和組裝2種核酸酶；另外，該技術還可以通過向受體直接導入sgRNA/Cas9 mRNA或sgRNA/Cas9蛋白的形式，實現目的基因的敲除及編輯，目前相關產品已商品化，使用方便。當然，該方法的普及仍存在一些技術難題，例如脫靶效應、怎樣將Cas9和gRNAs呈遞給成體組織細胞、受體啟動子的選擇等。總體而言，CRISPR/Cas系統正快速超越ZFNs和TALENs等其他編輯工具，成為微藻研究及其他生物研究的重要技術。

表1 3 種基因編輯技術的對比［14，16，23］

3 小結

微藻遺傳背景的逐漸清晰，以及現代生物學研究技術的不斷發展，使得對各種微藻進行基因工程學改造成為可能。本文對目前應用于微藻改造的遺傳介導體系及基因編輯技術做了簡要介紹，這些技術手段的運用，將為原本在微藻中產量基微，提取困難、不易被直接利用的一些生物活性物質的開發與應用提供廣闊的空間。

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