新生昆明乳鼠心肌細胞的原代培養

郭文靜++蔣薇薇++鄭春光++何萬里

摘 要：目的：建立穩定的分離、純化新生昆明乳鼠心肌細胞的培養方法。方法：用含EDTA的0.125%胰蛋白酶消化1～2d內的新生昆明乳鼠心肌組織，得到的細胞懸液經過濾、差速貼壁、5-溴尿嘧啶相結合的方式純化后在含20%胎牛血清DMEM新鮮培養基中培養。結果：14h后心肌細胞貼壁，呈圓形；48h后呈梭形，規律性搏動。結論：本研究應用的方法可以獲得成活率高、生長狀態良好的新生昆明小鼠心肌細胞，是一種穩定的心肌細胞培養方法。

關鍵詞：乳鼠；心肌細胞；原代培養

中圖分類號：R-322 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2017）06-0206-01

心肌細胞培養已成為研究心血管疾病發病機制的重要手段，穩定的心肌細胞適于各種研究，已有的研究報道多采用新生大鼠心肌細胞進行體外培養[1]，小鼠心肌細胞的原代培養因分離困難及生長狀態欠佳等原因報道較少，故本實驗在前人研究的基礎上[2]摸索新生昆明乳鼠心肌細胞的原代培養方法，最終建立了穩定的小鼠心肌細胞體外培養方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本實驗所用動物由河南省實驗動物中心提供，新生1～2d昆明小鼠乳鼠，雌雄不限。

1.2 新生昆明乳鼠的心肌細胞培養

1.2.1 取心肌組織

（1）在超凈工作臺外，將9只1-2日齡的新生昆明乳鼠埋入碎冰15s低溫麻醉；

（2）麻醉乳鼠放置超凈工作臺，75%的酒精擦拭消毒；

（3）無菌眼科剪在乳鼠胸腹部略左剪開，切口約1cm，暴露心臟，舒張期取心肌；

（4）剪下的心肌通過無菌PBS反復沖洗3次。

1.2.2 消化心肌組織

（1）眼科剪將漂洗過的組織剪碎至1mm3；

（2）將剪碎小塊置于含轉子的無菌小瓶，加0.125%含EDTA的胰蛋白酶（gibco）約4mL，恒溫磁力攪拌器里37℃低速消化15min；重復以上操作4次，吸取上清液于含有胎牛血清的無菌離心管中終止消化，血清和酶溶液之比為1：10；

（3）收集的細胞懸液1000rpm離心5min；棄上清，37℃水浴過的含20%胎牛血清（HYCLONE）、80%DMEM/F-12（80%DMEM/F-12）的新鮮培養基重懸細胞；

（4）200目不銹鋼濾網過濾細胞懸液。

1.2.3 心肌組織的鋪板、換液

（1）經濾過的細胞懸液接種于六孔板，37℃，5%CO2細胞培養箱中孵育90min，通過差速貼壁，初步分離貼壁快的成纖維細胞和貼壁慢的心肌細胞；

（2）孵育后的培養液上清（大部分都是心肌細胞）種入24孔板的三個孔中，加5-溴尿嘧啶（sigma），終濃度為0.1mmol，37℃，5%CO2細胞培養箱中培養；

（3）36h后更換新鮮培養基，倒置顯微鏡下觀察心肌細胞生長狀況。

2 結果

根據短時間多次消化的原則將心肌組織分離成單個的心肌細胞，并通過差速貼壁的物理方法和5-溴尿嘧啶殺成纖維細胞的化學方法相結合純化心肌細胞，純化后的心肌細胞鋪板，24h后更換新鮮培養基，36-48h間觀察細胞生長情況（圖1）。倒置顯微鏡下觀察未貼壁的心肌細胞細胞呈圓形或橢圓形，1-2h后貼壁生長，逐漸成梭形，多角形。一般數小時后即能出現自發性搏動，培養2-3d可長成單層并形成細胞簇，可觀察到培養的心肌細胞出現同步搏動。

3 討論

高效的心肌細胞培養是組織工程心血管相關研究的前提。新生小鼠在3d內其心肌細胞都有增值能力，出生后時間越短其心肌細胞分離成活率越高，越易貼壁生長。本實驗在前人方法學的基礎上加以改進，為了獲取更多有活性的心肌細胞，選擇在磁力攪拌器的幫助下多次短時間消化心肌組織；并通過200目濾網過濾、差速貼壁和5-溴尿嘧啶等方法純化心肌細胞。通過本研究可以建立穩定的心肌細胞培養方法。

參考文獻

[1]Piper HM Jacobson SL， Schwartz P Determinants of cardiomyocyte development in long term primary culture[J].J M o l Cardiac.1988 20（9）：825-835.

[2]彭雙清，楊進生.鐮刀菌毒素對心肌細胞膜電位的影響和硒的保護效應[J].中華預防醫學雜志，2003，37（6）：423-425.