以竹粉為基質固態培養蟲擬蠟菌及其產漆酶條件研究

呂琳+鄭晨琰+李宇濤+常帥+王超

摘 要：該研究探討了不同培養條件對Ceriporiopsis subvermispora NL-4固態發酵產漆酶的影響。結果表明，當培養溫度為30℃、培養基的初始含水率為64%、接種量為12%、起始pH 6.0時，該菌株活力最好且漆酶產量高；在條件下培養10d，漆酶活力可達12.45 U/g干基，比優化前提高了40%。

關鍵詞：蟲擬蠟菌；固態發酵；漆酶

中圖分類號 TQ925 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）08-0018-03

Abstract：Effect of culture conditions for the production of laccase by Ceriporiopsis subvermispora NL-4 were investigated in solid-state fermentation using the milled bamboo as main substrate.The results of single-factor test showed that the optimal culture conditions of the temperature，moisture of medium，inoulum volume and the initial pH were 30℃，64%，12% and 6.0.After the strain of C. subvermispora NL-4 was cultured for 10d growth under the conditions of the above parameters，the laccase activity was up to 12.45U/g dry medium，which was 40% higher than that under the primitive conditions.

Key words：Ceriporiopsis subvermispor；Solid-fermentation；Laccase

漆酶（laccase，p-diphenoloxidase，E.C.1.10.3.2）最初是從漆樹中獲得的，隨著生物技術的發展，微生物源漆酶有了較大的發展。由于漆酶在多個領域具有廣泛的用途，對漆酶的需求日益增多[1-2]。但目前微生物產漆酶的產量仍不高[3]，培養期過長導致染菌的可能性增大；漆酶的產量過低嚴重制約了其分離提取和純化[4]。采用農林生物質資源作為主要基質，通過固態培養的方式探索漆酶的產生及其產量的提高，不但可以有效節約資源，降低生產成本，減少污染物的排放[5]；同時，與液體發酵相比，固態發酵更接近于自然界的生態環境，有利于菌株產酶[6-7]。蟲擬蠟菌（Ceriporiopsis subvermispor）[8]是一類高產漆酶的白腐菌，本研究室對其進行了菌株的誘變，獲得了一株漆酶產量明顯提高的菌株C. subvermispora NL-4[9]。因此，本研究以Ceriporiopsis subvermispora NL-4為發酵菌株，以竹粉為主要基質，對該菌固態發酵產漆酶的條件進行優化，以提高漆酶產量和產酶效率[10]。

1 材料與方法

1.1 菌株 C. subvermispora NL-4，本研究室誘變選育獲得。

1.2 竹粉 竹粉，為毛竹（Phyllostachys pubescens）的加工剩余物，產自浙江臨安，烘干后過40目篩，干燥貯存備用。

1.3 試劑 葡萄糖等均為國產分析純，購自杭州木木生物科技有限公司；ABTS，購于sigma公司；馬鈴薯等購于臨安浙皖農貿城。

1.4 培養基 （1）PDA固體培養基（w/w）：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，KH2PO4 0.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，121℃滅菌20min[10]。（2）液體種子培養基（w/w）：酵母膏0.3%，葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，pH自然，121℃滅菌20min[10]。（3）固態發酵基礎培養基：在250mL三角瓶中裝竹粉30g，含水率60%，121℃滅菌20min[10]。

1.5 固態發酵 參照王超等固態培養方法[10]。

1.6 生化參數的測定 （1）粗酶液制備及酶活測定：參照高恩麗等方法并改進[11]。參照黃丹蓮等方法并改進[12]。（2）生物量的測定：用氨基葡糖法，參照彭丹方法測定[13]。

2 結果與分析

2.1 C. subvermispora NL-4生長曲線和產酶曲線 將液體種子以10%接種量接入固體發酵基礎培養基中，180r/min、28℃培養16d，漆酶產量和生物量如圖1。由圖1中菌體的生長曲線顯示，在前4d之內，菌體生長較慢，之后在4～8d之內菌體干重增加較快，呈現出對數生長期，8～11d后保持基本穩定[10]。酶活曲線顯示，C. subvermispora NL-4在固態發酵條件下，第5d才開始產酶，第12d漆酶活力達到最高，因此初步確定12d為后續發酵條件研究的培養時間。

2.2 培養溫度對C. subvermispora NL-4固態發酵產漆酶的影響 將固態發酵基礎培養基分別在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃條件下，180r/min、恒溫培養12d后測漆酶產量，結果如圖2。圖2表明，培養溫度對C. subvermispora NL-4固態發酵產漆酶的影響較大，30℃時漆酶酶活達到最高，40℃時僅為最高酶活的39%，因此確定30℃為固態發酵產漆酶的最適培養溫度[10]。

2.3 起始含水率對C. subvermispora NL-4固態發酵產漆酶的影響 將固態發酵基礎培養基的含水率分別調為44%、48%、52%、56%、60%、64%、68%和72%，180r/min、30℃培養12d后測漆酶產量，結果見圖3。圖3顯示，隨著培養基含水量的增加，漆酶活力也有提高，當培養基的含水率64%時，漆酶活力最高。含水率繼續增加時，漆酶活力迅速下降。

2.4 起始pH對C. subvermispora NL-4固態發酵產漆酶的影響 將固態發酵基礎培養基的pH分別調為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在180r/min、培養基的含水率64%、30℃培養12d，測得的漆酶活力見圖4。圖4顯示，培養基pH會影響菌株固態發酵產酶的活力，當pH為6.0和6.5時，漆酶活力均很高，但pH再增加時，漆酶活力有較大下降。因此選擇起始pH為6.0。

2.5 接種量對C. subvermispora NL-4固態發酵產漆酶的影響 在固態發酵基礎培養基中，分別接入3%、6%、9%、12%、15%、18%的液體種子，培養基的含水率64%、起始pH 6.0、在180r/min、30℃培養12d，結果見圖5。圖5顯示，接種量不同，漆酶活力變化不明顯，當接種量為12%時，漆酶活力最高。接種量增加到15%時，漆酶活力并無明顯提高反而下降，因此選擇12%為最適宜接種量。

2.6 C. subvermispora NL-4固態發酵產酶曲線 以竹粉為固體發酵基質，采用優化培養基及培養條件進行培養，即接種量12%、培養基起始含水率64%、起始pH6.0、在180r/min、30℃培養16d，研究C. subvermispora NL-4的菌絲體生物量以其漆酶活力的變化，如圖6。與優化前相同，最初1～2d，菌體量增長緩慢；而隨著培養時間的延長，菌體生物量逐漸增加；在第4～7d呈現對數生長期，第9生物量最大；菌株在第5d產酶量開始有較明顯增加，第10d達到最高峰（12.45U/g干基）[10]。

3 結論

（1）對培養條件的優化結果為：培養溫度30℃、培養基起始含水率64%、起始pH6.0、接種量12%。

（2）按優化后培養條件，C. subvermispora NL-4在第10d后其產漆酶活力達到最大值12.45 U/g干基，比優化前提高了40%。

參考文獻

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