紫外誘變選育大腸桿菌營養缺陷型菌株的研究

寧祎　李基麗　道吉吉　王春臺　劉新瓊

摘要：營養缺陷型是一種生化突變株，它的出現是由基因突變引起的。營養缺陷型菌株在遺傳學、食品生物技術、微生物代謝等領域的研究中均具有重要作用，另外它還是研究基因的結構與功能的常用材料。該研究以大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5a為實驗材料，利用紫外線（uv）對其進行誘變，并且采用青霉素法濃縮營養缺陷型細菌，采用逐個測定法檢出營養缺陷型，利用生長譜法對缺陷型菌株進行鑒定、分析，得到了4株穩定的營養缺陷型突變株，分別為賴氨酸、組氨酸、精氨酸和嘧啶營養缺陷型菌株。

關鍵詞：大腸桿菌；營養缺陷型；紫外誘變

微生物是遺傳學研究中常用的材料，常用多種方法誘發其基因突變進行遺傳育種，并且突變頻率遠遠超過自發突變。誘變劑主要包括物理誘變劑和化學誘變劑兩大類，物理誘變劑有紫外線、X-射線、γ射線、a射線，微生物誘變中常用紫外線（uv）進行物理誘變。DNA對紫外線有強烈的吸收作用，尤其是堿基中的嘧啶，紫外線能使同鏈DNA分子的相鄰嘧啶間形成胸腺嘧啶二聚體，結構發生改變，阻礙堿基正常配對，阻礙DNA的復制或引起堿基排列順序的變化，導致遺傳基因發生變異，從而產生突變或死亡。

大腸桿菌由于其結構簡單，遺傳背景已研究清楚，是遺傳學和分子生物學研究的極好材料。大腸桿菌紫外誘變和營養缺陷型菌株的選育，是遺傳學實驗中的一個重要實驗，通常情況下在本科生課堂開設該實驗，按照傳統的方法，很難得到理想的實驗結果。為此，筆者在多年教學的實踐基礎上，摸索出了一套成熟的實驗方法，能夠得到穩定的營養缺陷型菌株。

1.材料與方法

1.1出發菌種 大腸桿菌（Escherichia coli）菌株：DH5a。

1.2培養基 肉湯液體培養基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，超純水1 000mL，pH7.2，0.103 5mPa高壓滅菌15min。加倍肉湯液體培養基：牛肉膏6g，蛋白胨20g，Nacl 30g，超純水1 000mL，0.103 5mPa高壓滅菌15min。基本固體培養基（g/L）：七水硫酸鎂0.2g，檸檬酸鈉2g，四水磷酸氫銨鈉3.5g，磷酸氫二鉀10g，葡萄糖20g，瓊脂20g，超純水1 000mL，pH7.0，0.055mPa高壓滅菌30min。基本液體培養基：七水硫酸鎂0.2g，檸檬酸鈉2g，四水磷酸氫銨鈉3.5g，磷酸氫二鉀10g，葡萄糖20g，超純水1 000mL，pH 7.0，0.055mPa高壓滅菌30min。無氮基本液體培養基（g/L）：七水硫酸鎂0.2g，檸檬酸鈉2g，磷酸氫二鉀10g，葡萄糖20g，超純水1000mL，pH 7.0，0.055mPa高壓滅菌30rain。2倍氮基本液體培養基：七水硫酸鎂0.2g，檸檬酸鈉2g，磷酸氫二鉀10g，硫酸銨2g，蛋氨酸0.2g，葡萄糖20g，超純水1 000mL，pH 7.0，0.055mPa高壓滅菌30min。固體完全培養基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCI 5g，超純水1 000mL，瓊脂20g，0.103 5 mPa高壓滅菌15min。

1.3主要試劑 20種基本氨基酸、7種維生素（硫胺素、核黃素、吡哆醇、泛酸、對氨基苯甲酸、煙酰胺、生物素）、嘌呤、嘧啶、青霉素鈉鹽、冰醋酸、乙酸鈉、氫氧化鈉、硫酸鎂、蔗糖、生理鹽水、0.1mol/L醋酸緩沖液（pH4.0）、0.1tool/L NaOH。混合氨基酸（包括核苷酸）共分7組，其中第1組到第VI組各有6種氨基酸（包括核苷酸），每種氨基酸（包括核苷酸）等量充分混合，第VII組為脯氨酸，因容易潮解，故單獨組成。各組具體組成如表1所示。混合維生素：把硫胺素、核黃素、吡哆醇、泛酸、對氨基苯甲酸、煙氨酸及生物素等研細.充分混合即可。

1.4菌液制備

1.4.1菌體的活化與培養 實驗前14-16h，挑取少量DH5a菌體，接種于盛有5mL肉湯培養液的三角瓶中，37℃培養過夜。第2天添加5mL新鮮的肉湯培養液，充分混勻后繼續培養3-5h。

1.4.2收集菌體 將活化的菌體菌液取5mL倒入離心管中，3 500r離心10min，棄去上清液，吸入5mL生理鹽水，打勻沉淀形成懸液。

1.5紫外線誘變處理 處理前先開紫外燈（15W）穩定30min，然后吸取菌液3mL均勻的涂布于培養皿內，置于紫外燈下，距燈管28.5cm處；先連蓋在紫外燈下滅菌1min，然后開蓋處理1min（處理時間依70%的殺菌率而定）；照射后先蓋上皿蓋，再關紫外燈并注意避光。吸取3mL加倍肉湯培養液，注入處理后的培養皿中，37℃恒溫箱內避光培養18h。

1.6突變型的篩選與檢出

1.6.1青霉素法淘汰野生型 吸取5mL處理菌液于滅菌離心管中，3 500r離心10min。棄上清液，加人生理鹽水，打勻沉淀，離心洗滌3次，加生理鹽水至原體積。吸取菌液0.1mL于5mL無氮基本培養液中，37℃培養12h。加入等體積2倍氮基本培養液，并加入青霉素鈉鹽使最終濃度約為1 000單位/mL，達到殺死野生型，濃縮缺陷型的目的。培養12、16、24h時分別取菌液0.1mL，涂布基本及完全培養基，置37℃恒溫箱中培養。

1.6.2逐個測定法檢出營養缺陷型 以上平板培養36-48h后，進行菌落計數。選用完全培養基上長出的菌落數大大超過基本培養基的那一組，用牙簽挑取完全培養基上長出的菌落100個，分別先點種基本培養基，后點種完全培養基，置于37℃恒溫箱中培養。培養12h后，選擇在基本培養基上不生長，而在完全培養基上生長的菌落，再在基本培養基的平板上劃線，置于37℃恒溫箱培養。24h后不生長的可能是營養缺陷型。

1.7生長譜鑒定

1.7.1突變菌株的培養與收集 將可能是缺陷型的菌落接種于盛有5mL肉湯培養液的離心管中，37%培養14-16h。培養后，3 500r離心10min，倒去上清液，加生理鹽水，打勻沉淀，然后離心洗滌3次，最后加生理鹽水到原體積。

1.7.2營養缺陷型的鑒定 吸取經離心洗滌的菌液150uL涂布于基本固體培養基中。將培養皿底等分8格并標記，依次取5uL各組混合氨基酸（包括核苷酸）、混合維生素和脯氨酸分別滴于平板每格的中央。然后置于37℃恒溫箱培養24-48h，觀察生長圈，當某一格內出現圓形混濁的生長圈時，即說明是某一氨基酸、維生素或核苷酸的缺陷型。

2.結果與分析

大腸桿菌菌株DH5a經紫外誘變處理，通過青霉素法淘汰野生型，進行生長譜測定，分別用8組不同的混合氨基酸和維生素等進行篩選，得到了4株不同營養缺陷型的突變菌株（圖1）。如圖1-a，在2個重復的補充培養基上，分別在I號區域長出了菌落，根據營養成分的比較，發現該菌株為賴氨酸營養缺陷型菌株。如圖1-b，在2個重復的補充培養基上，分別在Ⅱ號區域長出了菌落，通過營養成分的比較，推定該菌株為組氨酸營養缺陷型菌株。如圖1-c，在2個重復的補充培養基上，分別在I號和Ⅱ號區域同時長出了菌落，通過營養成分的比較，推定該菌株為精氨酸營養缺陷型菌株。如圖1-d，在2個重復的補充培養基上，分別在II號和VI號區域同時長出了菌落，通過營養成分的比較，推定該菌株為嘧啶營養缺陷型菌株。

3.討論

大腸桿菌誘變處理與營養缺陷型篩選是普通遺傳學實驗中的一個重要實驗，大腸桿菌誘變處理的方法很多，但常用物理方法誘變處理，由于誘變之后的菌株所占的比例相當小，必須淘汰野生型的大腸桿菌菌株而篩選突變的菌株。細菌中常用的篩選方法是青霉素法，青霉素是一種殺菌劑，能夠抑制細胞壁的合成，從而可以殺死正在生長的大腸桿菌，而對不生長的大腸桿菌則沒有致死作用，因此，在含有青霉素的基本培養基中，野生型大腸桿菌能生長而被殺死，突變之后的菌株不能生長可被保存。隨后采用逐個測定法檢出營養缺陷型，并用生長譜法鑒定被初步確定為營養缺陷型的菌株，最終篩選營養缺陷型菌株。本研究利用紫外誘變處理，誘變處理的過程中防止光修復的產生，并且對輻射的距離和時間進行了優化，其間經過嚴格的篩選，獲得了4種不同的營養缺陷型菌株，結果通過進一步驗證，表現穩定。