壯藥壯通飲對大鼠內源性腦神經干細胞歸巢后神經元功能的影響

陳曉鋒+吳世嫦+王婧婧+劉燕平+李凱風+何乾超+劉強

【摘要】目的：觀察壯藥復方壯通飲對腦梗死模型大鼠內源性神經干細胞歸巢后神經元功能的影響。方法：240只大鼠分為模型組、假手術組、壯通飲治療組、正常組，采用線栓法制作腦梗死模型，于術后1、3、7、14、21、28d這6個時間點分批處死大鼠。用免疫組化法檢測大鼠海馬區BrdU、Nestin和梗死區域及相對應區域的MBP、SYN的陽性細胞數目。結果：模型組腦缺血區域相對應區域MBP、SYN陽性細胞大量表達，正常組和假手術組海馬區少量BrdU、Nestin陽性細胞。模型組和壯通飲治療組BrdU、Nestin陽性細胞表達增多，MBP、SYN陽性細胞表達減少。壯通飲治療組BrdU、Nestin、MBP、SYN陽性細胞表達量多于模型組，BrdU、Nestin陽性細胞表達在第7天達到高峰，MBP、SYN陽性細胞表達于第14天達到高峰。結論：壯通飲可以促進腦梗死后內源性神經干細胞的增殖，誘導分化為神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞，并發揮正常的神經功能。

【關鍵詞】壯通飲；內源性神經干細胞；NSC；歸巢；神經元

【中圖分類號】R29【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）08-0029-06

腦梗死是臨床上常見的缺血性腦血管疾病，隨著中國進入老齡化社會，腦梗死發病率和致殘率呈增高態勢，腦梗死區域的神經細胞的凋亡是必然的[1]。神經細胞是不可再生是長期以來的共識，作為神經細胞和神經膠質細胞的前體，內源性神經干細胞（Neural Stem Cell，NSC）具有增殖、遷移及分化功能，在腦缺血后神經損傷的修復過程中扮演重要角色[2]。壯通飲是治療腦梗死的壯醫藥經驗方，前期研究發現壯通飲影響新生大鼠海馬神經干細胞增殖分化[3]。本實驗通過觀察壯通飲對腦梗死后內源性神經干細胞歸巢后的神經元功能的影響，為闡明壯通飲促進神經增殖分化為成熟神經元后功能機制提供實驗依據。

1實驗材料

11實驗動物選用清潔級雄性健康SD大鼠240只，體重（250±10）g，由廣西醫科大學動物實驗中心提供（批號：SCXK桂～0004）。

12試劑鼠抗BrdU單克隆抗體（批號：BM0201）、兔抗nestin多克隆抗體（批號：A00806-1）、兔抗MBP多克隆抗體（批號：BA0094）、兔抗SYN多克隆抗體（批號：A00941）、山羊抗兔IgG（批號：1512174091）、ABC試劑盒（批號：d0110816）、DAB試劑盒（批號：AR1022）均購自武漢博士德生物工程有限公司。

2方法

21動物分組將240只大鼠隨機分為模型組、假手術組、壯通飲治療組、正常組，每組又設1、3、7、14、21、28d 6個時間點。每個時間點10只大鼠。

22藥物制備壯通飲：扶芳藤30g，參三七10g，黃花倒水蓮25g。藥材煎煮兩次，合并兩次煎液，蒸發去水分至濃稠狀，進一步干燥，4℃保存備用。臨用前使用蒸餾水溶解浸膏至生藥材含量為20 g/mL。

23MCAO模型建立參照Longa線栓法[4]制作MCAO模型。模型制作成功標準如下：①提尾懸空實驗陽性；②右眼Horner征；③爬行時向左劃圈；④站立時向左側傾倒。假手術組除不進行大腦中動脈線栓外，其余操作均同模型組。

24給藥方法壯通飲治療組在造模后給予壯通飲水煎液（按單位體重的劑量來算，大鼠的等效劑量相當于成人用量的63倍[5]，灌胃，每日2次，每次748g生藥/kg，其他組同時給予等體積的無菌蒸餾水灌胃，灌胃至造模后1、3、7、14、21、28d 6個時間點處死時。

25BrdU標記增殖細胞各組動物均從處死前24h開始，腹腔注射BrdU（50mg/kg），1次/4h，共4次，末次注射后12h處死動物。

26組織切片制備各組大鼠于造模后1、3、7、14、21、28d 6個時間點取標本，將腦組織移入多聚甲醛中4℃固定6h，取材，脫水，包埋，切片。

27免疫組化方法切片經脫蠟，高溫修復后，加入配好的03%的過氧化氫甲醇溶液（甲醇80mL+001MKPBS 100mL+30%過氧化氫）30min，用001MKPBS溶液沖洗后，加入10%正常羊血清，室溫靜置30min，甩干分別加相應的一抗，4℃過夜。用001MKPBS溶液沖洗后，滴加生物素化二抗（山羊抗兔IgG），室溫靜置30min，用001MKPBS溶液沖洗后，加入辣根過氧化酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫靜置30min，用001MKPBS溶液沖洗，采用SABC法染色，切片加葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸鎳胺溶液顯色（不超過5min），自來水沖洗干凈，蘇木素復染2min，自來水沖洗，梯度酒精脫水，樹膠封片，光鏡下觀察。

28觀察指標分別觀察各指標免疫組化染色陽性細胞的分布特點及形態特點。每只動物各個指標各取相對應位置切片3張，放大倍數×400，隨機選取5個顯微鏡視野，計數陽性細胞數取平均值。

29統計學處理實驗數據符合正態分布，以均數±標準差（x±s）表示，用SPSS 220統計軟件對數據進行處理分析，同組不同時間點及組間比較比較采用單因素方差分析，P<005表示差異有統計學意義。

3結果

31BrdU免疫組化染色結果各組各時間點大鼠海馬齒狀回區域均見BrdU陽性細胞。正常組和假手術組海馬區少量的BrdU陽性細胞，差異無統計學意義（P>005）。模型組和壯通飲治療組BrdU陽性細胞表達多于假手術組（P<005）；壯通飲治療組BrdU陽性細胞表達多于模型組（P<005）。在不同時間點，正常組和假手術組BrdU陽性細胞表達無統計學意義（P>005）。模型組、壯通飲治療組BrdU陽性細胞表達于第7天達到頂峰，之后呈現逐漸下降之勢。詳見圖1～4，表1。

32Nestin免疫組化染色結果在各組各時間點大鼠海馬齒狀回區域均有Nestin陽性細胞表達。正常組和假手術組大鼠的海馬區可見到少量的Nestin陽性細胞，差異無統計學意義（P>005）。模型組和壯通飲治療組Nestin陽性細胞表達多于假手術組（P<005）。壯通飲治療組Nestin陽性細胞表達多于模型組（P<005）。在不同時間點，正常組和假手術組Nestin陽性細胞表達也無統計學意義（P>005）。模型組Nestin陽性細胞表達量于造模后開始增多，1個周達到高峰，之后逐漸下降，這與壯通飲治療組表達趨勢類似。詳見圖5～8，表2。

33MBP免疫組化染色結果在各組各時間點大鼠缺血區大腦皮質和相對應的區域均可見不同數目的MBP陽性細胞。正常組和假手術組可見到大量的MBP陽性細胞表達，差異無統計學意義（P>005）。模型組和壯通飲治療組MBP陽性細胞表達量少于假手術組（P<005）。壯通飲治療組MBP陽性細胞數目多于模型組（P<005）。在不同時間點，正常組和假手術組MBP陽性細胞數目無統計學差異（P>005）。壯通飲治療組和模型組MBP陽性細胞表達于造模后3d開始增多，14d達到頂峰。詳見圖9～12，表3。

34SYN免疫組化染色結果在各組各時間點大鼠缺血區大腦皮質和相對應的區域均見SYN陽性細胞表達。正常組和假手術組SYN陽性細胞表達量差異無統計學意義（P>005）。模型組和壯通飲治療組SYN陽性細胞表達少于假手術組（P<005）。壯通飲治療組第3、7、14天SYN陽性細胞表達量多于模型組（P<005）。在不同時間點，正常組和假手術組SYN陽性細胞表達量無統計學意義（P>005）。模型組和壯通飲治療組造模后3d起，SYN陽性細胞增多，第14天達到峰值。詳見圖13～17，表4。

4討論

壯通飲作為治療腦梗死的傳統壯醫藥經驗方，由扶芳藤、參三七、黃花倒水蓮組成。藥理學研究表明，三七總皂苷可通過上調Bcl-2、Nestin、BDNF[6]、EGF蛋白的表達，從而促進神經干細胞增殖，并且抑制神經細胞凋亡。扶芳藤水煎液、醇提液能明顯抑制血栓形成，延長凝血酶原時間，縮短小鼠凝血時間和出血時間[7]；還能改善營養物質的供應，以減輕局灶性腦缺血后腦細胞的缺血性損傷；通過抑制腦組織中IL-1β和TNF-α的表達對大鼠急性腦缺血再灌注損傷進行保護[8]。黃花倒水蓮總皂苷（PTS）可明顯延長體外家兔血漿復鈣時間 、凝血酶所致纖維蛋白凝固時間及APTT，體內給藥可有效延長小鼠凝血時間，而對PT無明顯影響，提示PTS可能通過對抗凝血通路的關鍵酶（凝血酶），影響內源性凝血系統從而發揮抗凝血作用[9]。前期研究發現壯通飲可影響新生大鼠海馬神經干細胞增殖分化[3]，但對于它的歸巢后神經元功能的影響，目前缺乏有力的實驗室證據。國內外對增殖后的神經元的鑒定多還停留在形態學水平及特異性標記表達方面，較缺乏是否具有成熟神經元功能檢測的研究。歸巢后的神經元能發展成為與受損區域神經組織相一致的細胞類型，并能行使相應的神經功能是干細胞治療的關鍵。成熟神經元不僅要具有典型的神經元的形態、特異性標記，還要求具有興奮性，能和其他神經元形成突觸聯系，產生突觸電位。正常成熟的神經元具有電生理功能，能夠產生動作電位是成熟神經元的重要標志。研究不僅可以在細胞層面通過Brdu、Nestin檢測觀察壯通飲干預下內源性干細胞增殖、分化情況；還可以在功能層面通過MBP、SYN檢驗歸巢后神經元功能情況。

Brdu是一種胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，在細胞增殖周期的S期代替胸腺嘧啶整合入新合成的DNA中，因而Brdu陽性細胞可以用來標記新增殖細胞[10]。內源性神經干細胞被激活后，可以增殖分化，產生新的神經細胞，包括神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞等。Nestin又名神經上皮干細胞蛋白，屬于中間絲蛋白，主要在神經干細胞內一過性表達，當干細胞向著終末細胞分化完成后，其表達停止[11-12]，因此實驗選擇巢蛋白作為成熟神經干細胞的標記物質。MBP，即堿性髓鞘蛋白，是少突膠質細胞的特殊標記物，少突膠質細胞的主要功能是在中樞神經系統中包繞軸突、形成絕緣的髓鞘結構、協助神經電信號的跳躍式高效傳遞，維持和保護神經元的正常功能[13]。有研究顯示，作為中樞神經系統成髓鞘膠質細胞，少突膠質細胞對缺血應激非常敏感，缺血缺氧將導致早期的髓鞘脫失，缺氧、缺血是導致少突膠質細胞損傷的主要因素之一[14-15]。成年SD大鼠腦缺血再灌注后急性期梗死區皮質髓鞘相關蛋白（MyT1）基因表達增加，促進少突膠質細胞的再生形成，從而參與腦缺血后的早期的損傷修復[16]。本研究中，模型組和壯通飲治療組由于受到腦缺血影響，少突膠質細胞減少，MBP陽性細胞表達下降，從第3天起，模型組和壯通飲治療組MBP陽性細胞表達持續增加，第14天達到高峰，壯通飲治療組MBP陽性細胞數目明顯高于模型組。這表明，腦缺血損傷后，內源性神經干細胞在分化過程中，一部分分化成了少突膠質細胞，在中樞神經系統中包繞軸突、形成絕緣的髓鞘結構、協助神經電信號的跳躍式高效傳遞，維持和保護神經元的正常功能。壯通飲治療可以促進內源性神經干細胞的增殖及分化，并能起到正常神經元功能作用。

突觸素（Synaptophysin，SYN）是突觸囊泡膜上的一種與突觸結構和功能密切相關的鈣結合蛋白，又稱P38，是神經元形成神經突觸的重要標記蛋白，是突觸發生的標志。突觸素還參與到不同神經元之間的信息傳遞過程中，直觀反映突觸傳遞效能。腦梗死發生后，梗死灶中的突觸結構解體，神經元代謝能力和蛋白合成顯著減少，突觸素表達隨之減少[17-19]。因此SYN可用來作為檢測突觸的密度、分布和功能的重要標記物。本研究中，正常組和假手術組由于神經元未受到明顯損傷，彼此間維持正常接觸，表現為一定數量SYN陽性細胞表達。部分神經元于腦缺血早期凋亡，神經元突觸聯系喪失，模型組SYN陽性細胞表達減少。部分NSC被激活、增殖分化為神經元，表現為SYN陽性細胞表達逐漸增多。壯通飲治療組SYN陽性細胞表達量明顯多于其他組，提示壯通飲可能通過促進缺血腦組織形成新的神經突觸，修復了腦缺血的神經損傷。參考文獻

[1]劉暉，石志革，尤年興.不同年齡腦梗死患者TOAST分型與血脂和纖維蛋白原的相關分析[J].中國臨床神經學，2012（04）：449-451.

[2]Ikedab T.Stem cells and neonatal braininiury[J].Cell Tissue Res，2008，331（1）：263.

[3]陳曉鋒，王婧婧，陸惠.壯通飲對體外培養新生大鼠海馬神經干細胞增殖分化的影響[J].天然產物研究與開發，2014（26）：1099-1102.

[4]Longa EZ， Weinstein PR， Carlson S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]. Stroke， 1989，20（1）：84-91.

[5]徐淑云.藥理實驗方法學[M].3版.北京：人民衛生出版社，2009.

[6]鐘森，陳文超，徐永強，等.三七總皂苷對腦缺血再灌注損傷大鼠神經干細胞相關調節因子及腦細胞凋亡的影響[J].中國中醫急癥，2010，19（2）：279-282.

[7]周智，韋奇志，吳植強，等.扶芳藤對血液流變學及凝血功能影響的研究[J].廣西醫學，2011，33（7）：810.

[8]肖艷芬，肖健，王坤，等.扶芳藤提取物對大鼠急性腦缺血再灌注后IL-1β與TNF-α的影響研究[J].時珍國醫國藥，2011，22（2）：404.

[9]寇俊萍，李景峰， 閆瑾，等.黃花倒水蓮總皂苷對凝血系統及血栓形成的影響[J].中國藥科大學學報，2003，34（3）：257- 260.

[10]譚峰，王健，陳晶，等.電針對MCAO模型大鼠海馬區內源神經干細胞表達的影響[J].中國中西醫結合雜志，2017（02）：198-203.

[11]Jun H，Hussaini SM，cho CH，et al.Gadol45b Mediate Electroconvnlsice shock Induced Porliferalion of Hippocampal Neural Stem Cell[J].Brain stimul，2015，8（6）：1021-1024.

[12]Hosseini SM，Farahmandnia M，Raziz，et al.12 hours after cerebral ischemia is the optimal ime for bone marrow mesenchymal stemcell transplantation[J].Neural Regen Res，2015（16）：904-908.

[13]孔迪，王翠云，龐永博，等.大鼠腦硬死后內質網應激對髓鞘堿性蛋白表述的影響[J].中華實用診斷與治療雜志，2017（01）：23-25.

[14]李凱.少突膠質細胞在早產兒缺血缺氧性腦損傷關鍵作用的研究進展[J].國際神經病學神經外科學雜志，2012，39（4）：387-389.

[15]陳應柱，劉剛，楊德剛，等.大鼠腦缺血后胼胝體少突膠質細胞變化的特征[J].中風與神經疾病雜志，2011，28（1）：7-11

[16]李華杰，吳堅，朱林鳳，等.局灶腦缺血再灌注成年模型大鼠大腦髓鞘相關蛋白的基因表達[J].中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（50）：9389-9392.

[17]Ruan GP， Han YB， WangTH. et alcomparative study among three different methods of bone marrowmesenchymal stem cell transplantation followingcerebral infarction in rats[J]. Neurol Res，2013，35（2）：212-220.

[18]Liu YP， Seckin H， Izci Y， et al. Neuroprotective effectsof mesenchymal stem cells derived from humanembryonic stem cells in transient focal cerebralischemia in rats[J]. J Cereb Blood Flow Metab，2009，29（4）：780-791.

[19]程率芳.骨髓間充質干細胞移植腦梗死大鼠：神經功能恢復與突觸素的表達[J].中國組織工程研究，2016，20（28）：4182-4187

（收稿日期：2017-02-23編輯：梁志慶）