恒溫擴增實時熒光檢測技術檢測痰液對肺結核患者診斷價值的Meta分析

孫寶彬 謝明娟 陳效友

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恒溫擴增實時熒光檢測技術檢測痰液對肺結核患者診斷價值的Meta分析

孫寶彬 謝明娟 陳效友

目的 評估結核分枝桿菌RNA恒溫擴增實時熒光檢測技術(simultaneous amplification and testing forMycobacteriumtuberculosis，SAT-TB)檢測痰液標本對肺結核的快速診斷價值。方法 檢索中國學術期刊全文數據庫(CNKI)、萬方數據庫、維普數據庫、PubMed、ScienceDirect和Cochrane圖書館等數據庫，收集有關探討SAT-TB檢測痰液對肺結核診斷價值的所有文獻，檢索起止時間為建庫至2016年12月。擬定入選標準、排除標準，2名研究者分別獨立進行文獻資料提取及文獻質量評估，采用軟件Meta-DiSc 1.4進行Meta分析。結果 共檢索出168篇文獻，依據入選標準和排除標準，納入了9篇文獻進行分析，包含了5137例臨床患者痰標本，所有標本均進行了SAT-TB檢測和痰結核分枝桿菌培養。9篇文獻質量采用QUADAS-2評價表評價，文獻偏倚風險主要為患者選擇方面。Meta分析結果顯示，SAT-TB法檢測痰液診斷肺結核的匯總敏感度為87.0%(95%CI:86.0%～89.0%)，特異度為90.0%(95%CI:88.0%～91.0%),陽性似然比(positive likelihood ratio，PLR)為6.91(95%CI:4.04～11.84)，陰性似然比(negative likelihood ratio，NLR)為0.09(95%CI:0.06～0.15)。 結論 SAT-TB檢測痰液對肺結核快速診斷具有較高的敏感度和特異度，值得臨床進一步推廣應用。

結核，肺； 診斷技術和方法； 核酸擴增技術； Meta分析(主題)

結核病仍舊是威脅著人類健康的主要問題之一。據世界衛生組織估計，2015年全球新增結核病患者約1040萬例，死亡約140萬例；我國仍然是一個結核病高負擔國家[1]，結核病的防治形勢依然嚴峻。結核病的診斷方法目前主要包括痰涂片鏡檢、培養法、免疫學診斷、分子生物學診斷技術[2-3]。然而痰涂片鏡檢敏感度較低，雖然培養法有較高的敏感度，但耗時較長，至少需要3～8周。免疫學診斷技術如γ-干擾素釋放試驗(interferon gamma release assay, IGRA)主要用于結核潛伏感染的診斷，在活動性結核病診斷中的價值尚未得到公認。隨著分子生物學技術的發展，近年來涌現出許多可用于結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)快速診斷及鑒定的方法[4]。但傳統擴增DNA的檢測方法易受環境污染的影響，存在假陽性，同時，由于核酸擴增中抑制物的存在，可出現假陰性，給臨床診斷帶來困擾。結核分枝桿菌RNA恒溫擴增實時熒光檢測技術(simultaneous amplification and testing forMycobacteriumtuberculosis，SAT-TB)是以MTB特異的16S rRNA為靶標，通過恒溫擴增RNA技術，熒光標記探針與靶標片段的擴增產物雜交后釋放出熒光信號，通過對熒光信號進行實時監測，因簡化了檢測方法和針對RNA進行擴增而有效降低了實驗室污染造成的假陽性[5-6]，且其檢測結果可作為區分死菌和活菌的依據，理論上有利于用藥后的療效監測[7]。SAT-TB檢測法是國內研發具有知識產權專利保護的新穎方法，自2010年開始在臨床使用以來，近期發表的研究證明了SAT-TB在快速診斷肺結核方面具有獨特的優勢。本研究收集了所有相關文獻，采用Meta分析評估SAT-TB技術檢測痰液在肺結核中的診斷價值。

方 法

1. 文獻納入標準：①采用痰標本SAT-TB技術診斷肺結核；②診斷試驗采用痰液MTB培養陽性作為診斷肺結核的金標準；③診斷試驗具有獲取診斷價值評估的所有數據，即敏感度、特異度或真陽性值(true positive，TP)、假陽性值(false positive，FP)、真陰性值(true negative，TN)及假陰性值(false negative，FN)；④研究對象必須是來自臨床疑似肺結核患者，入選研究必須是臨床診斷試驗；⑤發表檢索的文獻語種為中文和英文。

2.文獻排除標準：①檢測標本為非痰標本的研究；②缺乏診斷試驗的敏感度或特異度或其他重要診斷數據；③非臨床診斷試驗，而是實驗室研究；④肺結核的診斷標準非細菌學陽性作為依據，比如以臨床診斷作為判斷肺結核的標準；⑤發表的語種非英文及非中文，非論著形式發表，摘要、信函等形式的文獻均排除在外。

3. 文獻檢索策略：結合如下關鍵詞進行檢索。以“SAT-TB及肺結核”、“RNA恒溫擴增及肺結核”；“SAT-TB and pulmonary tuberculosis”、 “amplification RNA and tuberculosis”、“simultaneous amplification and pulmonary tuberculosis”等進行中文及英文關鍵詞檢索中國知網、萬方數據庫和維普數據庫、PubMed、ScienceDirect和Cochrane圖書館數據庫，檢索起止時間均為建庫至2016年12月31日。

4. 文獻篩選和資料提取：由孫寶彬和謝明娟對文獻進行篩選，并制定資料提取表格對文獻資料進行提取和錄入，交叉核對。提取內容包括：作者、發表時間、國家、標本種類、納入患者例數及診斷試驗評估需要的主要參數(TP、FP、TN、FN等)。

5. 文獻質量評價：診斷性試驗的文獻質量以QUADAS-2(quality assessment of diagnostic accuracy studies)評價表進行評價[8]，評價內容包括：(1)患者選擇：選擇的患者是否會產生偏倚；(2)待評價試驗：待評價試驗的實施或解釋是否會產生偏倚；(3)金標準：金標準的實施或解釋是否會產生偏倚；(4)患者診斷流程和進展情況：患者診斷的流程是否會產生偏倚。每項分別按標志性問題具體評價，每條標志性問題以“是”、“否”、“不清楚”評價，偏倚評估分為“高風險”、“低風險”、“不清楚”3個等級，若所有標志性問題的答案均為“是”，則該方面的偏倚評估為“低風險”；若有一個標志性問題的答案為“否”，則偏倚評估為“高風險”；若文獻中沒有詳細的內容判斷標志性問題，則風險評估為“不清楚”。其中前3個方面還需要進行臨床適用性評估，主要是判斷其與評價問題的匹配程度，也是分為“高風險”、“不清楚”、“低風險”3個等級，判斷方法與偏倚評估原理相同。由孫寶彬和謝明娟獨立評價文獻質量，如遇分歧通過與陳效友討論解決。

6. 統計學方法：用Meta-DiSc 1.4版軟件進行Meta分析。計算匯總敏感度(pooled sensitivity)、匯總特異度(pooled specificity)、陽性似然比(positive likelihood ratio, PLR)、陰性似然比(negative likelihood ratio，NLR)，并進行異質性分析，如各研究間異質性檢驗結果I2>50%，表明各研究間存在高度異質性，則采用隨機效應模型分析；如各研究間異質性檢驗結果I2≤50%，表明各研究間存在較小異質性，則采用固定效應模型分析，并繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)，同時計算曲線下面積(AUC)。

結 果

1. 入選文獻：共檢索文獻168篇 (CNKI 61篇，萬方數據庫54篇，維普數據庫 10篇，PubMed 6篇，ScienceDirect 37篇，Cochrane圖書館數據庫 0篇)，其中中文94篇，英文74篇。通過閱讀168篇文獻的文題、摘要及全文后，對非痰檢測標本、無明確診斷標準及無法獲得全文的文獻進行排除，對符合納入標準的9篇進行Meta分析,包括中文7篇，英文2篇。

圖1 文獻納入及排除流程圖

2.納入文獻相關信息及文獻質量：9篇文獻[5,9-16]共納入5137例患者送檢的臨床痰標本，一般情況如表1所示。按QUADAS-2評價表評價9篇文獻研究質量，患者選擇偏倚評估，8篇高風險，1篇不清楚，其臨床適應性評估均為高風險；待評價試驗偏倚評估，9篇均為不清楚，其臨床適應性評估均為低風險；金標準偏倚評估，9篇均為不清楚，其臨床適應性評估均為低風險；患者診斷流程和進展偏倚評估，8篇低風險，1篇高風險；納入的文獻總體質量合格。其中文獻[5,9-10,13-14,15-16]未提及是否為連續隨機病例；文獻[5,9-11,13-14,15-16]未避免病例對照類研究設計；文獻[5,9，13-14,15-16]未避免不恰當的患者排除；9篇文獻均未提及待評價試驗與金標準是否施盲。QUADAS-2評價信息如表2。

3. Meta分析結果：納入的9篇文獻報道了SAT-TB技術檢測痰液對肺結核的診斷價值。異質性檢驗，I2>50%(敏感度I2=88.8%，特異度I2=95.1%，PLRI2=95.3%,NLRI2=89.9%),P值均<0.01，提示研究間存在異質性，均采用隨機效應模型進行Meta分析。結果提示(圖2～5)匯總敏感度為87.0%(95%CI:86.0%～89.0%)，特異度為90.0%(95%CI:88.0%～91.0%),PLR為6.91(95%CI:4.04～11.84)，NLR為0.09(95%CI:0.06～0.15)。SAT-TB技術診斷肺結核ROC曲線的AUC為0.9699(圖6)。

討 論

一、SAT-TB 的工作原理

SAT-TB是一種核酸恒溫擴增技術和實時熒光檢測技術相結合的新型核酸檢測技術[17]，通過恒溫擴增MTB的RNA，熒光標記探針與靶標片段的擴增產物雜交后釋放出熒光信號，對熒光信號進行實時檢測，具有檢測速度快、效率高等特點。該項技術由于是國內研發，率先在國內臨床使用，因此近年來涌現了一批國內發表的SAT-TB對肺結核的診斷價值的研究。

表1 納入9篇文獻的相關信息

注 TP：真陽性值；FP：假陽性值; TN:真陰性值；FN：假陰性值

表2 納入研究的相關質量評價信息情況

注 LR：低風險；HR：高風險;UR:無風險

圖2 SAT-TB技術檢測痰診斷肺結核的敏感度

圖3 SAT-TB技術檢測痰診斷肺結核的特異度

圖4 SAT-TB技術檢測痰診斷肺結核的陽性似然比

圖5 SAT-TB技術檢測痰診斷肺結核的陰性似然比

圖6 SAT-TB技術檢測痰診斷肺結核的ROC曲線

二、痰液SAT-TB診斷肺結核的效率評價

從本研究篩選、收集的9篇研究結果分析，發現SAT-TB檢測痰標本在快速診斷肺結核方面具有較高的敏感度和特異度，以痰培養陽性作為診斷肺結核的金標準，結果顯示痰SAT-TB診斷肺結核的敏感度和特異度分別為87.0%(95%CI:86.0%～89.0%)和90.0%(95%CI:88.0%～91.0%)，且具有較高的PLR和較低的NLR。與其他痰分子生物學診斷技術進行比較,歐喜超等[18]以痰培養為標準，發現環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的敏感度和特異度分別為90.24%、96.86%，于霞等[19]同樣指出LAMP的敏感度和特異度為90.07%和93.33%。Moussa等[20]研究發現GeneXpert MTB/RIF敏感度和特異度為93.0%和98.3%。Yan等[21]分別對比了LAMP和GeneXpert MTB/RIF技術，發現SAT-TB技術診斷肺結核的敏感度最高為96.0%，但特異度最低為88.0%。

三、異質性分析

從該項研究的結果分析，9項研究之間存在較高的異質性，分析異質性產生的原因，可能與各項研究開展的實驗室PCR條件的不同、標本儲存的時間、標本前處理的方法、檢測人員操作原因等因素的干擾有關。兩項檢測痰液及支氣管肺泡灌洗液SAT-TB的研究中發現，在同一實驗室不同工作時間SAT-TB的檢出率均存在差異，檢測效率與標本凍存時間、標本運輸等因素相關[22-23]。以上可能是構成存在較高異質性的原因。在該項技術未來的臨床使用中對影響其檢測效率的因素將會發現更成熟的方法來降低其影響。

9篇文獻按QUADAS-2評價表評價后顯示，患者選擇方面偏倚風險較高，其中7篇患者選擇偏倚為高風險，此外，9篇文獻的金標準與待評價試驗均未實施盲法，此兩方面也可能為異質性的主要來源。

四、SAT-TB的檢測優點及假陰性、假陽性結果分析

SAT-TB法不僅具有高敏感度和高特異度的優點，由于該技術以MTB的RNA進行檢測，RNA在MTB死亡后可很快降解，該技術可更準確、更快速鑒別患者痰標本MTB為死菌還是活菌。因此，該技術可以作為抗結核藥物治療療效評價的指標。van der Vliet等[24]在肺結核患者服用利福平和氧氟沙星治療的第3天和第7天分別檢測DNA和RNA，發現RNA的量明顯下降，提示RNA檢測可用于療效監測。

目前，SAT-TB技術可認為是一種快速診斷肺結核的方法，9篇文獻中均存在一定的假陽性和假陰性結果。假陽性的原因可能系不同研究在實際操作中存在標本之間的交叉污染，由于所有研究均沒有交待檢測患者處于治療的何種階段，因此假陰性的原因不排除因治療后系死菌所致的可能，當然，也可能由于痰涂片法受標本取材、患者自身間斷排痰及標本菌量等影響，敏感度較低[25-26]。培養法雖是結核病診斷的金標準，盡管改進后的BACTEC快速培養系統使培養時間縮短至15 d左右，但與SAT-TB比較，其耗時仍較長，不能滿足臨床快速診斷的需要[27]。文獻檢索發現，SAT-TB對檢測肺泡灌洗液在肺結核診斷上具有較好的價值，范琳等[23]用SAT-TB技術檢測234例涂陰疑似肺結核患者的肺泡灌洗液，敏感度和特異度同樣高達81.0%和96.9%，提示此技術在檢測肺泡灌洗液診斷肺結核上仍然具有較大潛力。但由于類似的研究報道較少，本研究未納入支氣管灌洗液標本作為Meta分析的資料。對于肺外結核的診斷，成松等[28]用SAT-TB技術檢測90例確診結核性胸膜炎患者的胸腔積液，敏感度較高，達90.9%；但特異度較低，僅為72.1%；可能與臨床對照組患者的選擇有關。關于肺外結核的SAT-TB法診斷價值的研究仍然較少，尚待進一步研究。

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(本文編輯：范永德)

The diagnostic value of SAT-TB for detection sputum in patients with pulmonary tuberculosis: a Meta-analysis

SUNBao-bin,XIEMing-juan,CHENXiao-you.

BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101149,China

CHENXiao-you,Email:chenxy1998@hotmail.com

Objective To evaluate the rapid diagnostic value of simultaneous amplification and testing forMycobacteriumtuberculosis(SAT-TB) from sputum in patients with pulmonary tuberculosis. Methods All studies involved the diagnostic value of SAT-TB for detectionMycobacteriumtuberculosisRNA from sputum samples for pulmonary tuberculosis were searched in CNKI,Wanfang,VIP,PubMed,ScienceDirect and Cochrane Library databases from establishment to December 2016. The inclusion and exclusion criteria for screening literatures was formulated. Two researchers independently fetched the data from articles and assessed their quality. Meta-DiSc (version 1.4) was used for Meta-analysis. Results The literatures search resulted in 168 abstracts identified and 9 studies with full text were recruited for analysis including 5137 sputa samples from patients with pulmonary tuberculosis according to the inclusion and exclusion criteria, and all samples were detectedMycobacteriumtuberculosisRNA by SAT-TB and MTB by culture. The quality of 9 studies was assessed with QUADAS-2 and the main bias risk was case selection. In all studies, the pooled sensitivity, pooled specificity, positive likelihood ratio and negative likelihood ratio of SAT-TB were 87.0% (95%CI:86.0%-89.0%), 90.0% (95%CI:88.0%-91.0%),6.91 (95%CI:4.04-11.84) and 0.09 (95%CI:0.06-0.15), respectively. Conclusion The rapid diagnostic value of SAT-TB forMycobacteriumtuberculosisRNA from sputum samples for pulmonary tuberculosis is very high with high sensitivity and specificity. SAT-TB is worth for clinical application in the future.

Tuberculosis,pulmonary; Diagnostic techniques and procedures; Nucleic acid amplification techniques; Meta-analysis as topic

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.05.019

北京市醫院管理局“登峰”計劃專項(DFL20151501)；北京市高層次衛生技術人員培養項目(2014-3-083)

101149 首都醫科大學附屬北京胸科醫院

陳效友，Email: chenxy1998@hotmail.com

2017-02-06)