基于ITS條形碼序列早期篩選枸杞種內雜交種

石志剛++馬婷慧++萬如++李彥龍++王亞軍

摘要：利用核糖體內轉錄間隔區（ITS）條形碼序列，對枸杞雜交育種種內雜交種進行早期篩選研究。采用改進的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取枸杞葉片DNA，利用合成的特異引物對其DNA中的nrDNA ITS區進行擴增、克隆，對目的片段進行測序分析。結果表明：以寧夏枸杞種內的品種寧杞1號、寧杞2號、白花枸杞作為父母本，選配雜交組合，基于ITS條形碼序列對其種內雜交育種產生的雜交后代進行聚類分析，分析雜交后代與父母本的親緣關系與差異，對其雜交后代進行早期篩選。由結果可知，基于ITS條形碼序列可以作為早期篩選雜交育種后代的方法之一，對建立分子標記輔助育種技術、縮短育種周期具有重要意義。

關鍵詞：枸杞屬；ITS序列；DNA測序；篩選；雜交育種

中圖分類號： S337；S567.1+90.351文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0138-02

枸杞是我國重要的“藥食同源”功能型特色植物資源，經濟、生態、社會效益顯著[1]。寧夏是枸杞的原產地和主產區，截至2015年年底，寧夏枸杞種植規模達到5.71萬hm2，占全國種植總面積的42.5%；枸杞干果產量13萬t，占全國總產量的48%；年出口量6 500 t，出口額7 000萬美元，占全國出口量的65%，出口額的58%；枸杞生產總值突破50億元。寧夏地區自20世紀60年代就已經開展枸杞新品種育種工作，目前寧夏農林科學院自主選育出寧杞1號、寧杞2號、寧杞3號、寧杞5號、寧杞6號、寧杞7號、寧農杞9號等10余個新品種，國內科技工作者也選育出柴杞1號、蒙杞1號、精杞1號等新品種。但是枸杞育種在整體上與其他作物育種相比，還存在許多不足和缺陷，主要體現在以下幾點：（1）實用生產型品種相對偏少，在生產中大面積推廣應用的品種僅有寧杞1號、寧杞4號、寧杞5號和寧杞7號等4個新品種，并且其用途相對單一，不能很好地適應枸杞產業多元化發展的方向；（2）育種手段相對單一，育種周期長、速度慢。近年來，分子標記技術發展很快，對于深入了解植物基因的多態性、有針對性地選擇親本、對雜種后代進行早期鑒定等方面，都能提供更為有效的判斷依據，從而提高育種效率[2]。通過群體選優、雜交育種、細胞融合等技術，建立多樣化育種理論體系和技術體系，培育多用途的枸杞新品種，對于提升枸杞產業的研究水平和枸杞產業可持續發展意義重大。本研究以枸杞雜交育種親本和雜交品系為試驗材料，通過對其種內雜交育種產生的雜交后代進行基于核糖體內轉錄間隔區（ITS）條形碼序列的聚類分析，分析雜交后代與父母本的親緣關系與差異，以期對其雜交后代進行早期篩選。

1材料與方法

1.1試驗材料

以寧夏枸杞種內的品種寧杞1號、寧杞2號、白花枸杞作為父母本，以通過種內雜交育種產生的雜交后代05-04-17-b、05-04-31-b、05-06-27-b、05-38-36、05-31-01、05-32-31作為試驗材料，材料名稱、來源等見表1。

1.2試驗方法

枸杞葉片DNA提取參照文獻[3]的方法進行，采用改進的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）方法。PCR擴增引物設計、擴增程序、反應體系及目的片段的克隆參照筆者所在研究組前期的報道[4]。

1.3枸杞雜交育種父母本和雜交后代的親緣關系分析

采用MEGA 4.0分析軟件對ITS序列進行聚類分析。

2結果與分析

2.1ITS區序列長度和變異信息

寧夏枸杞不同品種間雜交種中，整個ITS序列長度變異范圍為559～631 bp，平均為595 bp；整個ITS1序列長度變異范圍為198～252 bp，平均為224 bp；整個5.8SnrDNA序列長度變異范圍都為154 bp；整個ITS2序列長度變異范圍為 207～225 bp，平均為217 bp。ITS區、分區長度及G+C含量變異見表2。

寧夏枸杞種內不同雜交種植物ITS序列特征如表3所示。整個ITS區排序后的總長度為631 bp，其中ITS1、5.8S、ITS2排序后的長度分別為252、154、225 bp。將gap（空位）作missing（缺失）處理時，由于5.8SDNA序列過于保守，不適合用作系統發育分析，因而在本研究中利用ITS1、ITS2區序列進行統計發育分析。整個轉錄間隔區（ITS1+ITS2）對位排列后總長度為477 bp，共有173個變異位點，變異位點數分別為114、59個，占36.3%；保守位點數304個，占63.7%；有10個信息位點，占2.1%，69個轉換位點，15個顛換位點，其中ITS1區的信息位點所占比例高于ITS2區，而ITS1區的轉換/顛換值高于ITS2區（表3）。

2.2親緣關系分析

對ITS區堿基序列進行聚類分析，從圖1中可以看出親緣關系與差異。

3討論

05-06-27-b、05-4-31-b、05-4-17-b具有相同的父母本，是寧杞1號×寧杞2號，基于ITS序列分析可知，05-4-17-b父本聚在一起，而其他2個具有父母本的序列特征，從ITS序列可以初步判斷3個雜交種為真雜種。

05-31-01、05-32-31具有相同的父母本，是寧杞1號×白花，基于ITS序列分析可知，05-31-01與母本ITS序列基本一致，初步可以判定它不含父本的基因，是否為雜交后代有待進一步確定；而05-32-31同時具有父母本的序列特征，初步判定其是真雜交后代。

05-38-36是寧杞2號×寧杞1號，基于ITS序列分析，雜種與母本具有完全一致的序列特征，初步可以判定它不含父本的基因，是否為雜交后代有待進一步確定。

枸杞是多年生灌木，成齡期在4年以上，雜交群體的保存目前多采用活體方法，占用大量的土地資源和人力，隨著雜交育種工作的開展，雜交群體的保存和早期鑒定對于提高育種、縮短育種周期尤為重要，亟需通過雜交后代的早期鑒定來克服和緩解龐大的雜交群體規模所帶來的困難和壓力。基于ITS序列差異，從聚類圖可以初步判斷父母本與雜交后代之間親緣關系的遠近，而且結合它們在植物學性狀、細胞學性狀、同工酶性狀等方面的差異，可以作為枸杞早期篩選雜交后代的依據之一。

參考文獻：

[1]石志剛，郭文林，門惠芹. 枸杞不同種質的nrDNA ITS序列分析研究[M]. 北京：中國林業出版社，2012：1-5.

[2]張漢明，許鐵蜂，秦路平，等. 中藥鑒別研究的發展和現代鑒別技術介紹[J]. 中成藥，2000，22（1）：101-110.

[3]Cheng K T，Chang H C，Huang H，et al. RAPD analysis of Lycium bararum medicine in Taiwan market[J]. Bot Bull Acad Sin，2000，41（1）：11-14.

[4]Shi Z G，An W，Fan Y F，et al. Preliminary studies on identification of Lycium Linn. germplasm resources by nrDNA ITS sequencing[J]. Agricultural Science and Technology，2008，36（16）：6687-6689.吳玉香，王漢琪，沈少炎，等. 不同施肥方案對太子參活性成分的影響[J]. 江蘇農業科學，2017，45（6）：140-143.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.036