蚯蚓與細菌協同作用對土壤中聚丙烯酰胺的降解效果

周東興++王兵++鄧杰++寧玉翠++斯琴畢力格++王廣棟+李勝男

摘要：從含有聚丙烯酰胺（PAM）的污泥中分離得到2株PAM降解菌PAM1和PAM5，通過16S rDNA序列分析，初步鑒定PAM1為Comamonas kerstersii，PAM5為Comamonas terrigena。通過24 d室內培養試驗，研究細菌與蚯蚓協同作用對土壤中PAM降解的影響。試驗共設置4個處理，分別為空白試驗（CK）、接種細菌（B）、加入蚯蚓（E）以及同時接入細菌和蚯蚓（BE），28 ℃恒溫培養。結果表明，在同一PAM污染濃度下，各處理PAM降解率均隨時間的增加而升高，培養24 d后各處理的降解率差異顯著，其降解率的大小順序為BE>B>E>CK。說明單獨加入蚯蚓、細菌以及同時接入蚯蚓和細菌都能顯著促進土壤中PAM的降解，且以蚯蚓與細菌協同作用對土壤中PAM的降解效果最好；在不同PAM濃度下，處理B、BE、CK對PAM的降解隨著PAM濃度的增加而降低；E處理對PAM的降解率隨PAM濃度的增加僅產生輕微波動。

關鍵詞：蚯蚓；細菌；協同作用；聚丙烯酰胺降解；PAM1；PAM5

中圖分類號： S181文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0259-04

聚丙烯酰胺（PAM）由丙烯酰胺均聚或與其他單體共聚而成，是一種線性水溶性有機高分子聚合物，能以任何比例溶于水，幾乎不溶于乙醚、苯、酯類、丙酮等一般有機溶劑，兼具絮凝性、增稠性、耐剪切性、降阻性、分散性等性能[1-2]。由于其良好的絮凝性能，PAM開始在水處理領域得到廣泛應用，包括原水處理、污水處理、工業水處理、城市生活污水處理等，目前仍然是國內外水處理領域使用量最大的水處理劑[3]。此外PAM也被廣泛應用于造紙、石油開采、紡織、農業等領域，有“百業助劑”之稱[4]。但在PAM被廣泛應用的同時，由于受到技術和工藝等水平的限制，PAM被排放到環境中，逐漸累積，造成環境中有大量的PAM殘留，最終進入土壤，長此以往會對土壤環境產生一定的影響[5]。雖然少量的PAM施加到土壤中會對土壤起到一定的改良作用，但是過量的PAM會引起土壤板結，使土壤透氣性變弱，從而影響作物的生長[6]。此外，PAM在環境中受各種理化及生物因素的影響會發生緩慢的降解，產生丙烯酰胺單體（AM），AM具有較強的神經毒性、致癌性及遺傳性毒性等，對環境造成污染的同時也會對人體產生直接或間接的危害[7-8]。

處理PAM最核心的問題便是PAM的降解。相比于利用物理或化學方法降解PAM，生物降解過程不產生劇毒的AM，無二次污染，具有經濟、環保等優點[9]。然而，在利用微生物修復受污染土壤的過程中，土壤受污染導致含氧量過低往往會限制土壤污染物的降解[10]。蚯蚓作為土壤生態環境中的重要組成部分，在修復污染土壤方面具有重要作用，研究發現蚯蚓能通過自身的生命活動，如運動、取食、挖掘等行為，改善土壤的通氣，促進外源添加到土壤中的微生物傳播[11-13]。但關于蚯蚓與微生物協同作用降解土壤中PAM效果的研究還未見報道。本試驗通過蚯蚓和細菌的單獨和混合培養，研究蚯蚓和細菌及其相互作用對土壤中PAM降解效果的影響，旨在探究蚯蚓與微生物聯合修復PAM污染土壤的可行性。

1材料與方法

1.1試驗材料

PAM購自天津致遠化學試劑有限公司，水解度30%。用于篩選PAM降解菌的污泥，取自黑龍江省哈爾濱市文昌污水處理廠。

選擇性液體培養基的組成：蔗糖0.50 g/L，PAM0.30 g/L，KH2PO4·3H2O 0.50 g/L，K2HPO4 0.50 g/L，MgSO4·7H2O 0.20 g/L，CaCl2 0.01 g/L，NaCl 0.50 g/L，pH值自然[14]。選擇性固體培養基：向上述培養基中加入15～20 g/L 的瓊脂粉，制成平板。富集培養基的組成：牛肉膏 3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L。

供試土壤為黑土，采自東北農業大學阿城試驗基地。釆集0～20 cm表層土，去除碎石、枯葉等雜物，自然風干，過 2 mm 篩備用。供試土樣未檢出PAM，可認為不含PAM，其基本理化性質為pH值6.64，速效磷含量25.60 mg/kg，速效鉀含量164.20 mg/kg，有機質含量28.10 g/kg。

供試蚯蚓為赤子愛勝蚓（Eisenia foetida），采自黑龍江省雙城市良順生物科技有限公司。試驗選擇形態大小均勻、有明顯環帶的成蚓。

1.2試驗方法

1.2.1菌種的篩選目前PAM是國內外水處理領域使用量最大的水處理劑，主要用于水和污水的預沉淀及污泥的增稠和脫水[15]。所以本試驗采用污泥作為分離PAM降解菌的來源。將采集的10 g污泥溶于90 mL無菌蒸餾水中，30 ℃、140 r/min 于搖床中振蕩培養3 h后，將其稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5的懸濁液。將每個稀釋度的懸濁液分別抽取 0.2 mL 于以PAM作為唯一氮源的選擇性固體培養基中，每個稀釋度作3個平行試驗，在30 ℃恒溫培養箱中培養5 d。

待平板長出菌落，選擇生長狀況良好且有明顯性狀差異的菌落，于牛肉膏蛋白胨固體培養基中劃線純化。對純化后的菌株進行平板脅迫馴化[16]，使選擇性培養基中的PAM濃度提高為500 mg/L，將分離出的菌株接種到平板上馴化，3次平行試驗，于30 ℃培養5 d后將各個菌株重新接到PAM濃度為700 mg/L的選擇培養基中繼續馴化，以此類推逐級增加PAM濃度，依次為 1 000、1 500、2 000 mg/L。最后挑選生長速度快、長勢好的菌株，接入牛肉膏蛋白胨斜面培養基中培養2 d，4 ℃ 保存備用。

將篩選出的菌株單獨及復合接種到新鮮的選擇性液體培養基中，30 ℃培養10 d，觀察PAM降解情況。

1.2.2PAM優勢降解菌的鑒定降解菌16S rDNA序列測定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。采用16S rDNA序列測定法對菌株DNA進行提取、擴增及序列測定。所得結果通過BLAST在線工具與GenBank中的核酸數據進行序列搜索比對，初步鑒定菌株。

1.2.3處理方法PAM作為一種常用的水處理劑，在污泥脫水前的投加量一般為3～5 mg/g干污泥，對于一些沉降性能差的污泥則需要更高的投加量[17]。污泥脫水過程中大量的絮凝劑被轉移到泥餅中，與此同時污泥中含有的大量PAM也會隨著污泥農用被轉移到土壤中。試驗設計中PAM的初始污染濃度為2、4、6 mg/g。

稱取300 g土壤樣品于500 mL廣口瓶中，用紗布封口。為了消除土著微生物的影響，將裝有土樣的廣口瓶于121 ℃濕熱滅菌20 min。將溶于無菌水的PAM與土樣充分攪拌混勻，使土壤初始PAM污染濃度分別為2、4、6 mg/g，每個污染濃度水平下設4個處理，CK表示空白對照，E表示只加入蚯蚓，B表示只接種細菌，BE表示接入蚯蚓和細菌，每個處理3次重復。加入蚯蚓的各處理分別加入10條成蚓，接種細菌的各處理分別加入10 mL菌懸液（PAM1、PAM5 2種菌比例 1 ∶1），其他處理接入同劑量的無菌水。試驗中土壤水分維持在田間最大持水量的60%，并定期補充水分。于28 ℃恒溫培養箱中培養 24 d。培養期間進行動態采樣，每隔4 d進行1次破壞性采樣。

1.2.4土壤中PAM的提取與測定PAM是一種水溶性高分子材料，易吸附和保留水分，可以以任意比例溶于水，一般不溶于有機溶劑，因此本試驗采用水洗提取法從土樣中分離PAM。先把樣品溶于蒸餾水中，用搖床振蕩2 h，使其均勻分散在水中，再用磁力攪拌器攪拌10 min，然后以4 000 r/min的轉速離心15 min，取上清液待測。為了徹底地提取樣品中的PAM，須對樣品中的PAM進行3次提取[17]。并將所得上清液按一定比例稀釋，然后采用淀粉-碘化鎘分光光度法[18]測定PAM的濃度。

1.3數據處理

利用Excel和SPSS 19.0等統計軟件對數據進行統計分析。采用Duncans方法對不同處理間的數據進行差異顯著性分析（α=0.05）。采用Origin 8.5軟件作圖。

2結果與分析

2.1PAM降解菌的分離及鑒定

通過平板脅迫馴化法分離篩選出2株PAM優勢降解菌，分別命名為PAM1和PAM5。試驗結果如圖1所示，在以PAM為唯一氮源的選擇培養基中，培養7 d時各處理中PAM的降解率達到穩定，PAM1、PAM5菌株對PAM的降解率分別為28.1%、30.8%，PAM1和PAM5進行1 ∶1復配對PAM的降解率能夠達到37.7%，所以采用PAM1與PAM5菌株 1 ∶1 復配進行后續試驗。經測序后獲得PAM1菌株 1 450 bp 的16S rDNA序列，序列在GenBank中進行BLAST比對后發現，與Comamonas kerstersii相似度達到99%；PAM5菌株 1 437 bp 的16S rDNA序列通過BLAST與GenBank中核酸數據進行序列搜索比對發現，它與Comamonas terrigena的相似度達到98%。

2.2同一濃度下蚯蚓與細菌對土壤中PAM降解的動態影響

本試驗研究土壤中3種不同PAM初始污染濃度下各處理（CK、B、BE和E）對PAM降解的動態影響。從圖2可以看出，土壤中PAM的初始污染濃度為2 mg/g時，各處理中PAM的降解率均隨時間的增加而升高；BE處理在培養12 d時，PAM降解率提升得很快，之后PAM的降解率緩慢升高；B處理和E處理的PAM降解率變化較為緩和；CK處理24 d后，土壤中PAM降解率僅為2.94%，顯著低于其他處理；BE處理中同時段PAM的降解率始終高于其他處理，B處理次之。結果表明，篩選出的降解菌在去除土壤中PAM的過程中起主要作用，同時蚯蚓可以進一步促進PAM降解菌對土壤中PAM的降解。這是由于微生物本身的移動性小，蚯蚓可以成為散布微生物的工具，蚯蚓體壁可附著微生物，伴隨蚯蚓的取食、排泄和挖掘活動，給微生物的傳播提供了條件。此外微生物降解有機污染物的過程實質上是還原物質失去電子的氧化過程，而微生物利用分子氧作為末端電子受體時，污染物被降解得最徹底（分解產物為CO2和H2O），蚯蚓的挖掘和活動能很好地改善土壤通氣，為微生物降解有機污染物提供良好的通氣條件。

當土壤中PAM的初始污染濃度為4 mg/g時，各處理降解率比較規律地提升；培養后期（12～24 d），E處理中PAM降解率顯著高于CK處理，這表明蚯蚓自身可能有促進土壤中PAM降解的能力；培養24 d后，各處理間PAM降解率差異顯著且排序為BE>B>E>CK（圖3）。

在土壤中PAM的初始污染濃度為6 mg/g時，培養24 d后BE和B處理的降解率要比其他處理高（P<0.05）；BE和B處理在培養12 d時，降解率都有顯著的提高，PAM的減少主要發生在培養0～12 d時段，之后PAM的降解速率減緩；此外，對于未接種PAM降解菌的CK和E處理中，PAM降解速度較為緩和（圖4）。

2.3不同PAM污染濃度下蚯蚓與細菌對PAM降解的影響

培養24 d后，不同污染濃度下土壤中PAM的降解率見表1，可見在3種污染濃度（2、4、6 mg/g）下，CK處理PAM的降解率均為最低，其他處理PAM降解率均顯著高于對照組，其中BE處理對PAM的降解率最高，分別為38.24%、3650%、32.28%，與CK處理相比，分別提高了35.30、3397、29.90百分點；B、BE處理與E處理相比也都存在顯著差異（P<0.05）；各處理對土壤中PAM的降解效果排序依次為BE>B>E>CK。研究表明，單獨加入蚯蚓、細菌以及同時接入蚯蚓和細菌都能顯著促進土壤中PAM的降解。接種細菌以及同時接入細菌和蚯蚓的處理比單獨接入蚯蚓處理的促進作用更加顯著。處理BE和B中，隨著土壤中PAM初始污染濃度的增加，對PAM的降解率均有下降。可能是因為PAM濃度過高影響了土壤的透氣性，也易引起土壤板結，不利于蚯蚓的活動與呼吸，同時影響了降解菌的繁殖及擴散。處理E中，隨污染濃度的增加，對PAM的降解率產生波動。

3結論與討論

微生物在降解PAM過程中起著舉足輕重的作用，主要是依靠它們產生特定酶，以PAM為營養源，在菌株生長及代謝過程中，將PAM降解為小分子有機物和無機物。目前有關PAM降解的研究主要針對液相如污水、采油廢水。魏利等從油田采出液中分離出硫酸鹽還原性PAM降解菌，20 d時對液相中的PAM降解率為61.2%[19-21]。包木太等從活性污泥中分離出的海球菌屬PAM降解菌，在最佳條件下5 d對溶液相中的PAM降解達到45.23%[20]。本研究表明，篩選出的2株降解菌1 ∶1復合培養7 d對PAM的降解率為37.7%，而僅向土壤中外源添加PAM降解菌（處理B）對土壤中不同PAM初始濃度的降解率分別為28.68%、2722%、 24.87%，低于溶液相中PAM的降解率。這是由于土壤中通氣條件不佳、含氧量低、微生物在土壤中擴散相對不充分等原因所致[21-22]。

蚯蚓作為土壤動物最大的常見類群之一，是土壤可持續利用的關鍵生物種，是生態系統的重要物質分解者，在促進土壤養分循環和改善土壤性狀方面發揮著巨大作用。目前，利用蚯蚓等土壤動物輔助微生物修復土壤有機污染物技術是一種新型原位生態修復技術[23-24]。本試驗表明，當土壤中PAM濃度為2、4、6 mg/g時，BE處理對PAM的降解率分別為38.24%、36.50%、32.28%，與B處理相比，分別提高了 9.56、9.28、7.41百分點，說明蚯蚓可以顯著提高微生物對土壤中PAM的降解率。與此類似，Asgharnia等研究表明，蚯蚓可以顯著促進菲降解菌對土壤中菲的降解[25]。Li等研究發現，蚯蚓能夠使土壤中五氯酚（PCP）降解菌的數量增加，從而促進對PCP的降解[26]。蚯蚓在土壤中的運動、取食及穿孔作用可以改善土壤物理結構，增加土壤的透氣性和透水性，使更多的氧進入土壤中，這就為提供更多降解過程所必需的終端電子受體提供了可能[27]。從土壤的結構和形狀方面分析，通過蚯蚓在土壤中的生物擾動作用，可以使土壤不斷混合，有助于微生物的傳播和擴散，還能增加微生物與污染物接觸的機會[28-29]。有研究表明，蚯蚓能通過取食行為，將有機污染物從土壤表面轉移[10]。除此之外，蚯蚓在土壤中活動的同時會排出富含營養成分的蚯蚓糞，還會以黏蛋白、氨和尿素等形式分泌一些黏性物質，這些排泄物和分泌物不僅可以增強微生物的活性，還可增加它們的生物量[24]。

篩選出2株PAM降解菌，通過16S rDNA序列分析，初步鑒定PAM1為Comamonas kerstersii，PAM5為Comamonas terrigena。同一PAM初始濃度，各處理中PAM的降解率均隨時間的增加而升高，培養24 d后對PAM的降解率差異顯著，降解效果依次為BE>B>E>CK。表明單獨加入蚯蚓、接種細菌以及同時接入蚯蚓和細菌都能顯著促進土壤中PAM的降解。接種細菌及同時接入蚯蚓和細菌的處理比單獨加入蚯蚓處理的促進作用更顯著。蚯蚓與細菌的協同作用能進一步促進土壤中PAM的降解。不同PAM初始濃度下，CK、BE和B處理對PAM的降解隨著初始污染濃度的增加而降低，E處理對PAM的降解率隨污染濃度的增加僅產生波動。

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