滇重樓內生菌分離及其發酵液抑菌活性

施蕊++王娟+葉敏+趙能++夏箐++李彪

摘要：為研究滇重樓內生真菌的抑菌活性，先從滇重樓塊莖中分離得到98株內生真菌，對峙試驗結果表明，其中有8株內生真菌對供試植物病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌有一定的抑制作用；內生真菌發酵液初提物抑菌試驗結果表明，3株內生真菌發酵液的提取物對供試植物病原菌有一定的抑制作用，分別為PPC-25、PPC-43、PPC-78，其他菌株的發酵液提取物對供試植物病原菌沒有抑菌活性。

關鍵詞：滇重樓內生菌；分離；發酵液提取物；抑菌活性

中圖分類號： S482.2+92文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0086-02

滇重樓[Paris polyphylla Smith var. yunnansensis （Franch.） Hand]分布于云南省、貴州省和四川省，生長在海拔 1 400～3 100 m的常綠闊葉林、云南松林、竹林、灌叢或草坡內。滇重樓根莖入藥，有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，用于疔腫癰腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛、驚風抽搐等癥狀[1]。另外，滇重樓的次生代謝產物甾體皂苷有止血、祛痰、抑菌、鎮靜鎮痛、抗早孕殺精子、抗細胞毒素等作用，臨床上用于治療功能性子宮出血、神經性皮炎、外科炎癥以及腫瘤等，具有顯著的療效[2-6]。隨著新藥的研究開發，滇重樓成為著名中成藥云南白藥、宮血寧膠囊等產品的主要原料，制藥工業需求量逐年遞增，滇重樓供不應求[7]。由于滇重樓種子有“二次休眠”現象，種苗繁育存在巨大困難[8]。目前滇重樓的繁殖方法主要是根莖切塊繁殖和組織培養等，但是在育苗過程中創口和組培苗容易受到病原菌侵染，導致滇重樓根腐病大面積發生，造成嚴重的經濟損失。植物內生菌在植物抵御外來有害病菌入侵、促進種子萌發、促進植物生長和植物有效成分代謝等方面起著重要的作用[9-13]。但是，有關滇重樓內生真菌的研究不多。

因此，研究滇重樓內生真菌的抑菌活性，有利于提高植物的抗病性；同時，研究結果能為共生真菌與植物的共生關系提供科學依據，為滇重樓的人工栽培提供技術參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1滇重樓塊莖來源滇重樓塊莖于2014年采自云南省普洱市。

1.1.2培養基試驗用培養基為PDA培養基。

1.1.3供試病原菌供試病原菌由云南農業大學農業生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室提供，供試病原菌株編號及名稱見表1，采用的病原菌均為植物土傳病害病菌。

1煙草黑脛病菌（Phytophtora parasitica var. nicotianae Tucker）

1.2試驗方法

1.2.1滇重樓內生菌分離取健康滇重樓植株的根狀莖，棄泥土，用水沖洗干凈，晾干水分，按照以下步驟進行表面殺菌處理：0.2%氯化汞消毒10～30 s，無菌水沖洗，75%乙醇消毒 10～60 s，無菌水沖洗，處理完畢后在無菌條件下將滇重樓樣品切成2 cm×2 cm的小塊，種植于PDA培養基內，培養5～10 d，觀察培養基中有無菌落形成，挑取菌落轉接入PDA斜面培養基中，按常規微生物學法分離、純化和保藏。

1.2.2對峙試驗滇重樓內生真菌的抑菌活性測定采用平皿對峙培養法，各供試病原菌和滇重樓內生真菌置于28 ℃黑暗條件下培養3 d后，用打孔器（直徑6 mm）沿其菌落邊緣打菌餅，將內生真菌與病原菌菌餅接種于PDA平板上距中心 15 mm 處同一直線上的2點中，同時以只接病原菌和內生真菌的平板作為對照，每個處理重復3次，分別置于28 ℃恒溫培養箱中黑暗條件下培養，每24 h觀察1次，選擇能夠抑制供試植物病原菌菌絲生長的內生菌進行液體培養，準備其發酵代謝物的抑菌活性研究。

1.2.3發酵液中代謝物質的萃取將選擇的有抑菌活性的內生菌接種于PDA液體培養基中，在28 ℃、220 r/min的搖床上培養7 d，待培養基中布滿菌絲，停止培養，挑去菌絲，用等量乙酸乙酯萃取10 h，65 ℃減壓蒸餾濃縮至2 mL，自然揮干稱質量，加乙酸乙酯2 mL保存。

1.2.4萃取物抑菌試驗利用1/10 000天平稱量內生菌發酵液粗提物，用無菌水將各溶劑萃取物分別稀釋成15、10、5 mg/mL 的溶液。配制馬鈴薯培養基，滅菌，備用。無菌條件下，將稀釋的不同發酵液粗提物與馬鈴薯培養基在（40±5） ℃ 條件下以1 ∶9的比例混合，倒入培養皿，冷卻制成有毒培養基平板后分別接入供試病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、煙草黑脛病菌菌餅（直徑9 mm），每個濃度、每個菌種均設3皿重復。以不加提取物的馬鈴薯培養基為對照。觀察菌落生長情況，在第7天測量菌落直徑，抑菌率按照公式（1）進行計算：

抑菌率=對照病原菌菌落直徑-處理組病原菌菌落直徑1對照病原菌菌落直徑×100%。（1）

1.2.5數據統計試驗所得數據采用SPSS 17.0進行方差分析。

2結果與分析

2.1滇重樓內生真菌和對峙試驗結果

從滇重樓植物中分離得到98株內生真菌，將這些內生真菌與供試植物病原菌進行對峙試驗。由表2可見，滇重樓內生真菌PPC-78和PPC-43對供試植物土傳病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌有很強的抑制作用，其抑菌率均在82%以上，且PPC-78對尖孢鐮刀菌的抑制率達到了100.00%；內生菌PPC-25的抑菌效果也很好，對立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌的抑制率在58.83%～7281%之間；內生真菌PPC-03、PPC-21、PPC-32、PPC-71和PPC-73對立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌也有不同程度的抑制效果。

2.2發酵液對立枯絲核菌的抑菌活性

采用對峙試驗中能夠抑制病原真菌生長的菌株發酵液初提物對立枯絲核病菌進行抑制試驗。

由表3可以看出，對峙試驗有抑菌效果的8株滇重樓內生菌中，發酵液提取物對供試植物病原菌有抑菌作用的菌株僅有3株，它們分別是PPC-25、PPC-43和PPC-78，其他

內生菌發酵液提取物對供試病原菌沒有抑制作用；PPC-25、PPC-43、PPC-78發酵液提取物對立枯絲核菌的抑菌率分別是9.76%、37.21%、67.44%，對尖孢鐮刀菌的抑菌率分別是8.65%、62.55%、83.11%，對煙草黑脛病菌的抑菌率分別是5.07%、47.66%、77.49%。相比而言，PPC-78發酵液提取物的抑菌活性最強，PPC-43次之，PPC-25最弱。其他菌株的發酵液初提物對供試植物菌株沒有抑制作用，但是活體對峙試驗有抑制作用，可能的原因有2點：（1）營養競爭；（2）植物病原菌刺激內生真菌產生有抑菌活性的物質。

3結論與討論

從滇重樓塊莖中分離得到98株內生真菌，對峙試驗結果表明，其中有8株內生真菌對供試植物病原菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌有一定的抑制作用，菌株編號分別為PPC-03、PPC-21、PPC-25、PPC-32、PPC-43、PPC-71、PPC-73、PPC-78；內生真菌發酵液初提物抑菌試驗表明，3株內生真菌發酵液的提取物對供試植物病原菌有一定的抑制作用，分別為PPC-25、PPC-43和PPC-78，其他菌株的發酵液提取物對供試植物病原菌沒有抑制活性。

所用的植物病原菌僅包括土傳病害菌立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌和煙草黑脛病菌，不能斷定除菌株PPC-03、PPC-21、PPC-25、PPC-32、PPC-43、PPC-71、PPC-73和PPC-78外的內生菌沒有抑菌活性，應繼續探索滇重樓內生真菌對其他病原菌的抑菌活性，包括植物病原菌和動物病原菌。

本研究僅對部分菌株的發酵液提取物抑菌活性進行研究，還應對其他菌株的發酵液提取物的抑菌活性進行研究；另外，本研究僅采用乙酸乙酯對發酵液中的物質進行初步提取。下一步研究將圍繞內生真菌代謝產物的分離、結構鑒定等方面進行。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.022