花藥培養在中美水稻雜交新品系選育中的應用

余波+李闖+曾生元++景德道+林添資+錢華飛++周義文++姚維成+孫立亭+杜燦燦++龔紅兵

摘要：以5份中國稻種質資源、2份美國稻種質資源為親本，靈活運用單交、回交、花藥培養等育種手段，實現中美水稻親本之間有利基因的互補、疊加、純合。通過對MS培養基的營養成分及其濃度進行精量調整，促進愈傷組織的誘導、分化，提高成苗率，選育出具有高產、優質、多抗、光溫鈍感廣適性水稻新品系24份，按其株葉形態分為2類，其中改良型中國水稻18份，改良型美國水稻6份。

關鍵詞：水稻；花藥培養；美國稻；育種

中圖分類號：S511.03文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2017）06-0065-03

水稻是我國最主要的糧食作物之一，我國有50%以上人口以稻米為主食，隨著農業生產的發展和人民生活水平的不斷提高，稻谷在糧食中的比重將繼續增長。但是，在耕地資源有限的前提下，如何提高水稻單位面積的產量，對保障我國的糧食安全具有重要的意義。當前，水稻育種中產量長期停滯不前，品質和抗性也有待提高，其中一個重要的原因在于目前我國各地的主栽品種基因的遺傳基礎狹隘，育種工作者所選用的雜交親本遺傳差異小，很難使當前水稻的發展更上一個臺階。近年，有學者對中美兩國水稻的基因遺傳背景進行調查，發現其多態率（遺傳差異）高達93.65%[1]。因此，推動水稻育種的國際化，使用不同國家水稻資源尤其是中美水稻材料進行雜交[2]，擴大雜交親本之間的遺傳差異，充分提高水稻的雜種優勢，對當前的水稻育種乃至世界糧食的安全都有巨大的推動作用。

中美水稻親緣關系較遠，雜交后代分離瘋狂且難于穩定[3]，育種選擇難度大，如何提高中美水稻雜交的選育效果，加速后代穩定是一個需要解決的問題。花藥培養是一種雙單倍體育種方法，具有提高選擇效率、縮短育種年限、純合目標性狀等眾多優勢，通過花藥培養技術與常規育種技術相結合，可以快速穩定中美水稻雜交后代。本研究以中美兩國水稻為親本，靈活運用單交、回交等育種手段，實現中美水稻親本之間有利性狀的互補、疊加；借助花藥培養技術快速穩定目標性狀，實現中美水稻優良基因的聚合。

1材料與方法

1.1材料

中國稻種質資源5份：鎮稻88、鎮稻16號、鎮稻18號、嘉禾218、H6/511；美國稻種質資源2份：DG9911772、P1002。

1.2方法

通過中國水稻與美國水稻單交、回交，取BC1F1、BC1F1′、F2稻穗進行花藥離體培養，一方面選育適宜在中國種植的具有優質、高光效、光溫鈍感、綜合農藝性狀優良的中國水稻品系，另一方面選育適宜在美國生長的結實率高、單產高的美國水稻品系。

2中美水稻選育流程

以下以鎮稻88與DG9911772雜交選育為例，結合圖1、表1說明中美2種類型水稻新品系的選育流程。

（1）中美水稻雜交配組：使用江蘇品種鎮稻88，美國水稻資源材料DG9911772進行雜交配組F1代。

（2） 將步驟（1）中得到的F1代分別與鎮稻88和美國稻資源材料DG9911772回交得到BC1F1、BC1F1′，再從BC1F1、BC1F1′中選單株分別進行花藥離體培養，選育具有優質、高光效、光溫鈍感、綜合農藝性狀傾鎮稻88的改良型單株，選育具有結實率高、單產高的傾DG9911772的改良型單株。

（3） 從F2中選綜合農藝性狀傾鎮稻88、DG9911772單株分別進行花藥離體培養，根據需要選育具有優質、高光效、光溫鈍感、綜合農藝性狀傾鎮稻88的改良型單株；選育結實率高、單產高的傾DG9911772改良型單株，具有優勢性狀但還需要改良的中間材料分別與鎮稻88和美國水稻DG9911772雜交，再利用花藥培養加速穩定，實現目標性狀的

改良。

（4）品系鑒定篩選：綜合考慮產量、品質、抗性、光溫反應等性狀，選出最優品系進行優勢鑒定。

3花藥培養流程

由于中美水稻基因遺傳背景的差異，花藥培養使用三步成苗法，對誘導、分化、生根3個不同發育階段的營養成分及濃度進行精量調整，促進愈傷組織的誘導、分化，提高成苗率。

3.1改良型MS培養基成分

3.1.1供試水稻材料花藥培養所用培養基母液按10倍濃度計算，母液A（大量元素）包括如下組分：KNO3 30 g/L、NH4NO3 16.5 g/L、KH2PO4 5 g/L、MgSO4·7H2O 3.7 g/L、CaCl2 4.4 g/L。按100倍濃度計算，母液B（微量元素）包括如下組分：ZnSO4·7H2O 500 mg/L、MnSO4·H2O 1 000 mg/L、H3BO3 500 mg/L、CuSO4·5H2O 2.5 mg/L、KI 83 mg/L、Na2MoO4·2H2O 25 mg/L、CoCl2·6H2O 2.5 mg/L。按100倍濃度計算，母液C（鐵鹽）包括如下組分：Na2-EDTA 5.6 g/L、Fe2（SO4）3·7H2O 4.3 g/L。按100倍濃度計算，母液D（有機元素）包括如下組分：肌醇10 g/L、煙酸0.05 g/L、鹽酸硫胺素0.05 g/L、鹽酸吡哆醇0.05 g/L、甘氨酸0.2 g/L。

3.1.2供試水稻材料愈傷組織誘導培養基利用上述培養基母液配成1 L誘導培養基，包括：母液A 100 mL、母液B 10 mL、母液C 10 mL、母液D 10 mL、濃度為 1 mg/mL 的2，4-D 5 mL、蔗糖40 g、瓊脂6 g、水解酪蛋白 1 g、山梨糖醇20 g、0.1 mg/mL的玉米素0.8 mL，pH值為58。

3.1.3供試水稻材料愈傷組織分化培養基利用上述培養基母液配成1 L分化培養基，包括：母液A 100 mL、母液B 10 mL、母液C 10 mL、母液D 10 mL、濃度為 2 mg/mL 的 6-BA 2 mL、濃度為0.5 mg/mL的NAA 0.5 mL、蔗糖30 g、瓊脂6 g、水解酪蛋白1 g、山梨糖醇10 g，pH值為5.8。

3.1.4供試水稻材料生根培養基利用上述培養基母液配成1 L的生根培養基，包括如下組分：母液A 100 mL、母液B 10 mL、母液C 10 mL、母液D 10 mL、蔗糖30 g、瓊脂6 g、水解酪蛋白1 g、山梨糖醇10 g、多效唑2 mg，pH值為5.8。

3.2花藥接種方法

3.2.1誘導培養取孕穗期劍葉葉枕距3～5 cm的幼穗，在8～12 ℃預處理8～10 d，消毒；取花粉處于單核時期的花藥接種在誘導培養基上進行離體培養；接種結束后將誘導培養基移至智能光照培養箱，關閉培養箱中燈管，并用報紙或黑布遮蓋培養箱透光處，防止外界光線射入，設定箱內溫度為 24～27 ℃，進行為期22～35 d的暗處理，形成愈傷組織。

3.2.2分化培養將誘導培養基中得到的愈傷組織轉接到分化培養基上，將分化培養基移至智能光照培養箱，設定溫度為24～27 ℃，設定光照時間為14 h/d，暗處理時間10 h/d。

3.2.3生根培養愈傷組織在分化培養基上經過16 d左右分化形成根和芽，長出綠色小苗，將綠色小苗從分化培養基中轉接到生根培養基上；將生根培養基移至智能光照培養箱，設定溫度為27 ℃，設定光照時間為14 h/d，暗處理時間 10 h/d。

3.2.4煉苗移植綠色小苗轉入生根培養基培養3 d后，所有試管苗均開始發根，當試管苗綠苗長至6～8 cm，具有6～10條長0.5～1.0 cm的根時，從試管中取出綠苗，洗去根部培養基，清水培養；隔日移栽至花培苗圃中事先做好的秧田里，使用遮陽網遮蓋；1周后移種大田。

3.3花培苗選育

綜合考慮產量、品質、抗性、光溫反應性，選出最優株系，次年進行鑒定篩選。通過2種美國水稻與5種中國水稻單交、回交、花藥培養，共篩選出改良型株系24份（表2），按其株葉形態分為2類，其中改良型中國水稻18份，改良型美國水稻6份。

4討論

4.1中美水稻雜交育種的優點

（1）有利于拓寬雙親的遺傳距離，提高有利性狀的遺傳效應。借助單交、回交、聚合育種逐步實現中美優良性狀（基因）的互補，無論是用我國的秈稻還是粳稻與美國水稻雜交，產量、品質、抗性等有利性狀都得到極大提高。

（2）雙親親和性好[4-5]，容易實現品種間雜交。由于仍然屬于亞種內雜交，中美水稻之間雜交表現出較好的親和性，如本研究中所用2個美國水稻（P1002、DG9911772）同5個中國水稻（鎮稻88、 鎮稻16號、鎮稻18號、嘉禾218、H6/511）雜交，F1結實率都在70%以上。

（3）有利于品質改良、選育穩定的優質品種[6]。美國水稻所攜帶的優質基因不同于中國水稻品種，其優質性狀受光

溫條件影響小，如P1002、DG9911772在江蘇種植和在海南種植其品質性狀（尤其是堊白）均表現同一水平的優質，利用美國水稻這一特性，可使我國水稻的品質得以進一步改良，實現中美水稻優中選優。

（4）有利于培育光溫鈍感性品種，提高品種適應性。從表3可以看出，2個美國水稻材料分別在江蘇句容與海南陵水種植，播種到齊穗所用時間僅相差3～6 d，表現為光溫鈍感；而中國水稻對光溫條件表現為敏感，在江蘇句容與海南陵水種植，播種到齊穗所用時間相差14～26 d。利用美國水稻對光溫鈍感這一特性，可以培育我國的光溫鈍感性品種，提高我國水稻品種的適應性。

（5）有利于培育綜合性狀優良的水稻新品系。美國水稻還具有抗倒伏性好[7-8]、葉片厚、對強光適應性強、光合效率高、成穗率高等優點，是改良我國水稻品種的理想材料。

4.2MS培養基改良效果

（1）同MS培養基相比，在誘導培養基、分化培養基、生根培養基中添加了水解酪蛋白（CH）、山梨糖醇這2種成分。水解酪蛋白（CH）是多種氨基酸的混合物，對胚狀體、不定芽的分化有良好的促進作用，能提高誘導分化效率；山梨糖醇能夠改善愈傷組織的質量，使綠苗分化率顯著提高。

（2）同MS培養基相比，在誘導培養基中添加了玉米素。玉米素在與植物激素2.4-D混用的條件下，能快速促進愈傷組織的誘導。

（3）同MS培養基相比，在分化培養基中添加了NAA。NAA在與植物激素6-BA混用的條件下，可以快速促進愈傷組織的分化。

（4）同MS培養基相比，在生根培養基中添加了2 mg/L多效唑。可以克服組織培養中試管苗長勢較弱，根系不發達的缺點，降低苗高，促進根系發育，健壯幼苗，提高移栽后成活率。

（5）使用三步成苗法，對誘導、分化、生根3個不同發育

階段的營養成分及其濃度進行精量調整，更加有利于愈傷組織的誘導、分化，花藥培養成苗、壯苗。

4.3花藥培養在中美水稻育種中的意義

（1）有利于育種材料純合，縮短育種年限。中美水稻之間遺傳差異巨大，后代分離瘋狂且難于穩定，花藥培養是一種實現育種材料快速穩定的技術，借助花藥培養的雙單倍體育種技術，可以快速穩定育種材料。

（2） 有利于排除同一基因位點內的顯性效應對后代選育的干擾，提高選擇效率。由于花藥培養所得到的組培苗是通過單倍體加倍形成的，其后代全部是純合的基因型，排除了基因位點內的顯性效應對后代選育的干擾，使不同基因位點非等位基因之間的加性效應、上位性效應得以充分表達，提高了選擇效率。

（3）有利于打破優良基因與不良基因之間的連鎖，實現中美水稻優良基因的聚合。中美水稻具有很多優良基因，但這些優良基因往往與不良基因之間存在著連鎖關系，通過花藥培養可以打破優良基因與不良基因之間的連鎖，實現中美水稻優良基因的聚合。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.016