基于ISSR—PCR分子標記的滑菇遺傳多樣性分析

李紅+張敏+肖千明++宋瑩++曹君

摘要：以遼寧省主栽的16個滑菇菌株為研究對象，應用ISSR分子標記技術對其遺傳多樣性進行了分析，從20條引物中篩選出9條多態性豐富、譜帶清晰且重復性好的引物進行了ISSR-PCR擴增。9條引物共擴增出101條帶，其中多態性譜帶92條，多態位點百分率為91%。遺傳相似系數變化范圍為0.59～0.90。在遺傳相似系數為0.69時，可將16個滑菇菌株劃為5大類群，為今后滑菇的分類鑒定及遺傳育種親本的選配提供了理論依據。

關鍵詞：滑菇；ISSR；分子標記；遺傳多樣性

中圖分類號： S646.1+60.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0039-03

滑菇（Pholiota nameko Ito et Imai）別稱光帽鱗傘、光帽黃傘、滑子蘑、光滑環銹傘、光蓋環銹傘、光蓋庫恩菇、珍珠菇，是一種較為常見的低溫型食用菌，具有豐富的營養成分和很強的藥理活性。滑菇是世界上五大人工栽培的優質食用菌之一。我國是滑菇的主要生產和消費大國，產量居世界首位，每年大量對外出口，國內市場滑菇價格高于香菇和平菇等其他菌類價格。目前滑菇栽培所用的菌株同名異物和同物異名現象嚴重，因此對滑菇菌株進行有效的分類和親緣關系鑒定是滑菇育種成功與否的首要因素。

ISSR是1994年由Zietkiewicz等創建的一種簡單序列重復區間擴增多態性分子標記，它是在SSR基礎上發展起來的技術，根據基因組廣泛存在SSR的特點，利用SSR本身設計引物，無需預先克隆和測序[1]。ISSR通常為顯性標記，呈孟德爾式遺傳，具有很好的穩定性和多態性，DNA用量少、技術要求低、成本低廉、通用性好，已成功地運用于居群生物學研究、菌株鑒定、物種的分類系統學比較，并作為構建遺傳圖譜的工具[2]。

在食用菌方面，ISSR技術較多用于種群內、種群間、物種間的系統發育和遺傳多樣性研究。秦蓮花等利用ISSR標記結合ITS分析，以豹皮香菇和虎皮香菇為外群，對12個香菇菌株進行遺傳分析，結果認為此方法是鑒別香菇菌株的良好方法[3]。王子迎等用13個ISSR引物對26個安徽野生香菇和6個栽培菌株進行了遺傳多樣性分析，并根據ISSR分析選擇遺傳距離遠近不同的親本進行雜交，評價了其雜種優勢[4]。馬志剛等基于重復序列（TATG），設計了7條引物，對側耳屬的22個菌株和1株雙抱蘑菇菌株的基因組DNA進行ISSR分析，驗證了重復序列（TATG）4在側耳屬中的存在[5]。Zhang等設計2個錨定ISSR引物，將17個香菇菌株很好地鑒別開[6]。但在滑菇方面，尚無相關研究報道。本研究應用ISSR-PCR分子標記的方法對滑菇菌株遺傳多樣性進行分析，以期為滑菇的分類鑒定及遺傳育種親本的選配提供理論依據。

1材料與方法

1.1供試菌株

本研究以遼寧省主栽的16個滑菇菌株為研究對象（表1）。

1.2培養基

PDB綜合培養基用于總DNA提取的菌絲培養，配方：馬鈴薯400 g，葡萄糖40 g，磷酸二氫鉀6 g，硫酸鎂3 g，蛋白胨 6 g，水2 000 mL，pH值不需要調整。

1.3試劑和儀器

ISSR-PCR 反應所用的Taq DNA Polymerase、dNTP、10×buffer、Mg2+購自北京鼎國昌盛公司，DNA marker（DL5000）、引物購自 TaKaRa （大連）有限公司。PCR 儀為德國 Biometra 公司的 Thermocycler型。

1.4引物

本研究使用的20個引物見表2。

1.5菌絲體培

將活化的菌絲切下0.5 cm2菌塊，接種于PDB綜合培養基，23 ℃搖床培養，轉數為150 r/min。將培養好的菌液，無菌水洗滌2次，汲干菌絲體表面的水分，-20 ℃保存備用。

1.6總DNA提取及檢測

采用改良的CTAB法[7]提取基因組總DNA，0.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測質量。

1.7PCR反應及電泳

引物參照加拿大哥倫比亞大學公布的ISSR引物序列[8]，由TaKaRa 有限公司（大連）合成。

PCR反應體系（20 μL）：模板DNA 200 ng/μL，dNTPs 200 μmol/L，引物0.75 μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 U，Mg2+ 2.5 mmol/L，10×buffer 2 μL，用ddH2O補至總體積20 μL。

擴增程序為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性 30 s，45～55 ℃ 退火1 min（退火溫度因不同引物而定），72 ℃延伸 2 min，38個循環；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR產物在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳，用GelDoc-It型凝膠成像系統照相。

1.8數據處理

電泳結果采取 0/1 賦值記帶，將在瓊脂糖凝膠上出現DNA片段的記為 1，不出現的記為 0，統計后輸入電腦，用聚類分析軟件NTsys進行聚類分析，并計算遺傳相似度。

2結果與分析

2.1基因組DNA提取

16個滑菇菌株基因組DNA圖譜見圖1。

2.2引物篩選

從20 條ISSR引物中篩選出9條多態性豐富、譜帶清晰且重復性好的引物，對16個供試菌株進行了ISSR-PCR擴增。9條引物共擴增出101條帶（圖2至圖5），其中多態性條帶為92條，多態位點百分率為91%。每條引物擴增出大約11條帶，DNA片段大小為250～2 000 bp。

2.2基于ISSR分析結果構建樹狀圖

16個菌株間的遺傳相似系數變化范圍在 0.59～0.90之間。當遺傳相似系數為 0.69時，供試菌株被聚類成5個類群：第1類為早壯、N109；第2類為N103、 N108、延滑；第3類

為丹9、申14、C31、西羽、EH、曲新、D工羽3、HSH，其中丹9和申14親緣關系最近，遺傳相似系數達到0.9；第4類為112、遼滑1；第5類為華3，與其他菌株親緣關系最遠，遺傳距離為0.59（圖6）。

3結論與討論

選擇雜交親本是食用菌雜交育種中最為重要的環節之一。一直以來，育種工作者都是通過表型分析的DUS（distinctness，uniformity and stability，簡稱DUS）測試來鑒定和選擇親本。這種方法耗時費力，鑒定結果也易受環境的干擾。隨著分子生物學技術的發展，在分子水平上進行親本菌株的選擇勢在必行。目前，關于滑菇分類鑒定多局限于傳統分類法和同工酶分析研究[9]，應用分子標記鑒定的研究報道較少。

本研究應用ISSR-PCR分子標記的方法對滑菇菌株遺傳多樣性進行了分析，從20條引物中篩選出9條多態性豐富、譜帶清晰且重復性好的引物進行了ISSR-PCR擴增。結果顯示9條引物均能將供試菌株區分開，表明ISSR分子標記對滑菇菌株遺傳多樣性分析是可行的。16個滑菇菌株遺傳相似性較高，遺傳背景比較一致，部分品種間親緣關系較近，可能與來源同一地區有關。

參考文獻：

[1]閆可，尹勇剛，傅常娥，等. 樺褐孔菌菌株遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 食用菌學報，2012，19（2）：26-30.

[2]王春暉，尹永剛，胡汝曉，等. 基于ISSR和RAPD標記的八株灰樹花栽培菌株遺傳多樣性分析[J]. 食用菌學報，2013，20（4）：1-5.

[3]秦蓮花，宋春艷，譚琦，等. 用ITS和ISSR分子標記技術鑒別香菇生產用種[J]. 菌物學報，2006，25（1）：94-100.

[4]王子迎，王書通. 安徽野生香菇遺傳多樣性及雜種優勢的ISSR分析[J]. 菌物學報，2006，25（2）：211-216.

[5]馬志剛，呂作舟，鄭和斌，等. ISSR標記在側耳屬菌株分類學中的初步應用[J]. 華中農業大學學報，2006，25（1）：55-59.

[6]Zhang Y，Molina F I. Strain typing of Lentinula edodes by random amplified polymorphic DNA assay[J]. FEMS Microbiol Lett，1995，131（1）：17-20.

[7]張丹，宋春艷，章爐軍，等. 基于全基因組序列的香菇商業菌種SSR 遺傳多樣性分析及多位點指紋圖譜構建的研究[J]. 食用菌學報，2014，21（2）：1-8.

[8]王守現，劉宇，張英春，等. 六個灰樹花菌株遺傳多樣性分析[J]. 北方園藝，2010（1）：201-204.

[9]張敏，肖千明，李紅，等. 滑菇主要栽培品種間親緣關系的同工酶研究[J]. 遼寧農業科學，2010（4）：25-27.馮濤，劉娟，華夏雪. 利用SSR、SRAP分子標記鑒定桃早熟芽變[J]. 江蘇農業科學，2017，45（6）：42-44.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.009