酒制對(duì)大黃中游離蒽醌在大鼠體內(nèi)組織分布的影響

吳育+彭曉清+姜曉燕+石美琴+楊水英+符映均+彭敏+蔡艷+蔣晟昰+許彥

[摘要] 傳統(tǒng)炮制理論指導(dǎo)思想“酒制升提”，大黃經(jīng)過(guò)炮制成為飲片酒大黃治療上焦病癥，如目赤腫痛，口舌生瘡等疾病，炮制前后大黃藥性的改變使得其臨床應(yīng)用側(cè)重點(diǎn)不同，為研究中藥炮制理論的科學(xué)內(nèi)涵，該文同時(shí)建立測(cè)定大鼠組織中蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素的液-質(zhì)聯(lián)用方法，通過(guò)分別灌胃給予SD大鼠大黃生品和酒制品水煎液，采用LC-MS測(cè)定組織（心、肺、腦、肝、腎）中蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素的含量，探討酒制對(duì)大黃中游離蒽醌成分在大鼠體內(nèi)組織分布的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示大黃酒制能明顯改變蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素在大鼠體內(nèi)的分布，其中各成分在心與肺組織中的分布增加，在肝和腎中的分布與生品組相比變化不大，而在腦中沒(méi)有檢測(cè)到3種成分，提示蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素不能透過(guò)血腦屏障。酒制對(duì)大黃中游離蒽醌成分在大鼠體內(nèi)的藥物組織分布有較大影響，這也驗(yàn)證了傳統(tǒng)中醫(yī)理論，酒大黃多用于治療上焦病癥，該研究結(jié)果為探討大黃炮制機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 蘆薈大黃素；大黃酸；大黃素；組織分布；液-質(zhì)聯(lián)用

Effects of wine processed Rheum palmatum on tissue

distribution of aloe-emodin， rhein and emodin in rats

WU Yu1，PENG Xiao-qing2， JIANG Xiao-yan1， SHI Mei-qin1， YANG Shui-ying1，

FU Ying-jun1， PENG Min1， CAI Yan1， JIANG Sheng-shi1 ， XU Yan1 *

（1. Department of Pharmacy， Nantong Chinese Medicine Hospital， Nantong 226001， China；

2. Medical School of Nantong University， Nantong 226001， China）

[Abstract] Under the traditional processing theory "wine processing could promote the efficacy"， Rhubarb after wine processing could treat the upper energizer diseases such as red swelling， and breath sores. Processing changes the medicinal properties of rhubarb， and thus results in different focuses in clinical application. In this study， a sensitive and specific method was developed for the determination of aloe-emodin， rhein and emodin in rats tissue. Rhubarb raw materials and its wine processed decoction were given to SD rats respectively by gavage administration， and then the contents of aloe-emodin， rhein and emodin in the tissues （heart， lung， brain， liver， kidney） were determined by HPLC-MS to explore the effect of wine processing on free anthraquinones in rat tissues. Experimental results showed that wine processing can significantly change the distribution of aloe emodin， rhein and emodin in rats in vivo， and the distribution of these components was increased in heart and lung tissues.There was no significant change of distribution in the liver and the kidney as compared with raw product group， and these three ingredients were not detected in the brain， indicating that aloe-emodin， rhein， emodin can not pass through the blood brain barrier.Therefore， wine processing had greater effect on distribution of free anthraquinones in rat tissues.This also verified the theory of traditional Chinese medicine， providing experimental basis for rhubarb processing mechanism.

[Key words] aloe-emodin； emodin； rhein； tissue distribution； HPLC-MS

大黃始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為我國(guó)臨床應(yīng)用最為廣泛的中藥材之一，是傳統(tǒng)瀉下類中藥的代表，來(lái)源于蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.、唐古特大黃R. tanguticum Maxim. ex Balf.或藥用大黃R. officinale Baill.的干燥根及根莖，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃之功效[1]，大黃具多類藥效活性成分，其中以蒽醌類、二蒽酮類、茋類鞣質(zhì)和多糖研究最多；其藥理作用主要有調(diào)節(jié)胃腸功能、抗病原微生物、抗腫瘤、保護(hù)心腦血管、抗炎保肝、抗衰老、抗菌抗病毒、降壓降脂、抗腫瘤等作用[2-7]。

中藥飲片入藥是中醫(yī)藥臨床用藥的一大特色，也是區(qū)別中藥和天然藥物的顯著標(biāo)志。中藥炮制基本原理的核心是中藥飲片炮制后其藥性發(fā)生了改變，而根源還是炮制后其內(nèi)在物質(zhì)基礎(chǔ)內(nèi)涵發(fā)生了改變。2015年版《中國(guó)藥典》中記載了大黃生品、酒大黃、熟大黃和大黃炭[8]。大黃酒制后，引藥上行，臨床廣泛用來(lái)治療上焦病癥，如目赤腫痛，口舌生瘡等，療效顯著。現(xiàn)代研究表明，酒制能顯著影響大黃中主要活性成分含量，游離蒽醌含量增加，結(jié)合蒽醌類衍生物含量下降[9-10]，從而降低大黃生品瀉下效力。另有研究表明，大黃酒制后對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌的抑制作用較大黃生品好[11]。

近年來(lái)，大黃藥材或復(fù)方中蒽醌類成分體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)及組織分布研究多有報(bào)道[12-14]。然而，酒制對(duì)大黃中有效成分在大鼠體內(nèi)組織分布影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法，比較大黃生品和酒制品灌胃給藥后大黃酸、蘆薈大黃素和大黃素在大鼠體內(nèi)的組織分布狀況，進(jìn)一步揭示大黃酒制的炮制機(jī)制，為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-MS 2020高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司），包括SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器，質(zhì)譜為L(zhǎng)C-MS-2020單極四級(jí)桿，電噴霧離子源（ESI）；QF-3800氮?dú)獯蹈蓛x；AG285電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-2200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；弗魯克F6/10型組織勻漿機(jī)（上海達(dá)平儀器有限公司）；TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XW-80A微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

甲醇（色譜純，美國(guó)Tedia公司）；乙酸乙酯、乙酸（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；乙酸銨、乙酸鈉、維生素C、鹽酸（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）。大黃Radix et Rhizoma Rhei購(gòu)自于安徽省亳州市藥材總公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室劉訓(xùn)紅教授鑒定為蓼科植物掌葉大黃的干燥根及根莖。酒大黃按照2010年版《中國(guó)藥典》一部規(guī)定的炮制方法制得。蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、1，8-二羥基蒽醌對(duì)照品（純度>98%）均購(gòu)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院。SD大鼠，雄性，體重200～230 g，由上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 色譜質(zhì)譜分析條件和數(shù)據(jù)處理

1.2.1 色譜條件 Kromsail C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-3 mmol·L-1乙酸銨（75∶25）等度洗脫，流速1 mL·min-1；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.2.2 質(zhì)譜條件 采用負(fù)離子選擇性檢測(cè)（SIM）模式，選擇的檢測(cè)離子質(zhì)荷比為268.8（大黃素、蘆薈大黃素），282.8（大黃酸），239.9（內(nèi)標(biāo)，1-8二羥基蒽醌）。其他工作參數(shù)設(shè)置為：電噴霧電離（ESI）；探針溫度350 ℃；曲形脫溶劑裝置（CDL）溫度280 ℃；加熱模塊溫度320 ℃；探針電壓4.5 kV；檢測(cè)器電壓1.5 kV；CDL電壓50 V；Q-array電壓為DC 50 V，RF 120 V；干燥氣流速5 L·min-1；霧化氣流速1.5 L·min-1。實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)采用中國(guó)藥理學(xué)會(huì)數(shù)學(xué)藥理專業(yè)委員會(huì)編制的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算軟件3P97處理。

1.3 生大黃及酒大黃供試品溶液制備

大黃生藥54 g，600 mL純凈水冷浸30 min，煎煮45 min，過(guò)濾；藥渣加入300 mL純凈水，煎煮20 min，合并濾液，濃縮至300 mL，4 ℃保存。酒大黃供試液制備同生品。

1.4 組織分布研究

雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為2組，其中1組為生品組，1組為酒制組，每組30只，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。按照大黃提取物10.0 mL·kg-1的灌胃劑量給藥，于給藥后5，15，30，60，120，240 min（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)10只大鼠，每組各5只）斷頭處死大鼠，立即解剖采集心、肺、腦、肝、腎樣品。當(dāng)即用0.9%冰生理鹽水沖凈表面血液及內(nèi)容物后，用濾紙吸干，稱重，加入2倍量冰生理鹽水勻漿，得到勻漿液，-20 ℃冷凍保存，備用。

1.4.1 樣品處理 精密吸取大鼠血漿或組織勻漿液100 μL，加入內(nèi)標(biāo)10 μL（161 mg·L-1），再加入50 μL pH為5的醋酸鹽緩沖劑和50 μL維生素C （100 g·L-1），渦旋30 s，加50 μL 0.1%HCl溶液，及0.8 mL乙酸乙酯，渦旋3 min，4 000 r·min-1離心5 min，分離乙酸乙酯層，吹干，用100 μL乙腈復(fù)溶，取上清液，12 000 r·min-1離心3 min，取20 μL進(jìn)樣，LC-MS測(cè)定。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素對(duì)照品適量，用甲醇配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（蘆薈大黃素 14.5 mg·L-1，大黃酸120 mg·L-1，大黃素 10 mg·L-1）。另精密稱取內(nèi)標(biāo)（1，8二羥基蒽醌）適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為161 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述溶液適量（除內(nèi)標(biāo)外），用甲醇稀釋得質(zhì)量濃度分別為蘆薈大黃素 0.014 5～14.5 mg·L-1，大黃酸0.12～120 mg·L-1，大黃素 0.025～10 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，于冰箱（4 ℃）內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 方法專屬性 空白組織、空白組織加入一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液、大鼠給藥后組織樣品色譜圖見(jiàn)圖1，可見(jiàn)組織中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾藥物的測(cè)定。組織樣品以肝組織為例。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限 取空白組織勻漿80 μL，加入20 μL混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，配制成相當(dāng)于蘆薈大黃素質(zhì)量濃度為2.9，5.8，11.6，58，290，1 450，2 900 μg·L-1，大黃酸質(zhì)量濃度為24，48，96，480，2 400，12 000，24 000 μg·L-1，大黃素質(zhì)量濃度為2，4，8，40，200，1 000，2 000 μg·L-1的樣品，按1.4項(xiàng)下方法操作，進(jìn)行色譜分析。以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值y為縱坐標(biāo)，待測(cè)物濃度x為橫坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行計(jì)算得回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1，各成分在測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度和準(zhǔn)確度 精密吸取蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素對(duì)照品混標(biāo)溶液20 μL加入100 μL空白肝組織勻漿液，配制高、中、低3個(gè)濃度的質(zhì)量控制（QC）樣品（蘆薈大黃素1 450，58，5.8 μg·L-1；大黃酸12 000，480，48 μg·L-1；大黃素1 000，40，4 μg·L-1）的含藥組織樣品，除不加入甲醇20 μL外，按“組織樣品處理”操作，每一濃度進(jìn)行6樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算QC樣品的測(cè)得濃度，與配制濃度對(duì)照，求得測(cè)定方法的準(zhǔn)確度（以RE表示）和精密度（以RSD表示），其中組織樣品測(cè)定數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。由表可知，生物樣本的分析方法符合有關(guān)規(guī)范要求。

2.1.4 提取回收率 精密吸取蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素對(duì)照品混標(biāo)溶液20 μL加入100 μL空白肝組織勻漿液，配制高、中、低3個(gè)濃度的質(zhì)量控制（QC） 樣品含藥組織樣品，除不加入甲醇20 μL外，按“組織樣品處理”操作，每一濃度進(jìn)行6樣本分析，以提取后的色譜峰面積與未經(jīng)提取直接進(jìn)樣獲得的色譜峰面積之比，考察樣品的提取回收率。其中組織樣品測(cè)定數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

2.1.5 穩(wěn)定性 按2.1.2項(xiàng)下方法配制蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素在組織樣品中的高、中、低3個(gè)濃度的QC樣品，每一濃度進(jìn)行3樣本分析，將上述3個(gè)濃度的樣品置于-20 ℃冷凍，分別貯存14 d后解凍以及3次凍融循環(huán)，考察生物樣本處理后室溫放置24 h的穩(wěn)定性。3個(gè)濃度QC樣品測(cè)定結(jié)果的RSD均小于10%，表明蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素在室溫下放置12 h和-20 ℃貯存14 d后解凍以及3次凍融循環(huán)條件下都具有較好的穩(wěn)定性。結(jié)果3個(gè)濃度QC樣品測(cè)定結(jié)果的RSD均小于10%，表明生物樣本處理后室溫放置24 h穩(wěn)定。

2.2 組織分布研究

2.2.1 非房室模型分析 按1.4項(xiàng)下方法操作，測(cè)定大鼠組織樣品，代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各時(shí)刻樣品中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素的濃度。然后將大鼠各組織中各成分濃度經(jīng)時(shí)過(guò)程采用3P97程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)矩分析，求得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素在各組織中的AUC并用其表示各成分在組織中的分布情況。各成分在組織中的分布見(jiàn)圖2。酒制能明顯改變蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素在大鼠體內(nèi)的分布，其中各成分在心與肺組織中的分布增加，在肝和腎中的分布與生品組相比變化不大，而在腦中沒(méi)有檢測(cè)到3種成分，說(shuō)明蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素較難透過(guò)血腦屏障。

3 討論

3.1 色譜質(zhì)譜分析條件優(yōu)化

為了實(shí)現(xiàn)峰形對(duì)稱并且能在較短時(shí)間內(nèi)同時(shí)測(cè)定分析3種成分，故對(duì)本實(shí)驗(yàn)中的色譜質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)3種成分在甲醇-3 mmol·L-1醋酸銨體系中有較高的響應(yīng)。同時(shí)，對(duì)流動(dòng)相中甲醇的比例也進(jìn)行了考察，最終使用75%甲醇等度洗脫可使各成分達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱。在上述色譜條件下，可實(shí)現(xiàn)樣品中3種成分在較短時(shí)間內(nèi)的同時(shí)分析。

蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和1，8-二羥基蒽醌（內(nèi)標(biāo)）的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3。本實(shí)驗(yàn)對(duì)質(zhì)譜的射頻電壓（RF）、霧化氣流速、毛細(xì)管電壓等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，確定了質(zhì)譜分析條件。同時(shí)考察了正離子模式和負(fù)離子模式下各成分的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式比正離子模式的響應(yīng)值更高。另外，經(jīng)過(guò)對(duì)各成分的全掃描確定了蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)荷比，分別為268.85，268.85，282.80，239.95。

3.2 樣品預(yù)處理方法優(yōu)化

樣品預(yù)處理是建立可靠、準(zhǔn)確的LC-MS分析方法的關(guān)鍵步驟。為了確保從組織中提取的分析成分有較高的回收率并且無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)干擾，故對(duì)生物樣品的預(yù)處理方法進(jìn)行了優(yōu)化。比較了蛋白沉淀法和液-液萃取法2種較為常用的處理方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用蛋白沉淀無(wú)法消除樣品中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。另外，考察了液-液萃取法，研究了不同的萃取溶劑（乙酸乙酯，乙醚，二氯甲烷，甲基叔丁基醚）對(duì)生物樣品預(yù)處理的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯作為萃取溶劑時(shí)可降低基質(zhì)效應(yīng)并得到較高的提取回收率。

3.3 靶向性評(píng)價(jià)

酒制后3種有效成分具有較強(qiáng)的心臟、肺臟趨向性，這與傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論中的“酒制升提”理論是相符合的，同時(shí)也對(duì)大黃經(jīng)酒制后能夠治療上焦病癥這一藥效進(jìn)行了有效的驗(yàn)證。

4 結(jié)論

傳統(tǒng)中藥炮制理論認(rèn)為：藥物酒制后有升提作用。從古至今，酒制法是中藥炮制的重要方法之一。中醫(yī)傳統(tǒng)炮制理論和臨床實(shí)踐均采用酒制品治療上焦病癥。本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定大鼠組織（心、肺、腦、肝、腎） 中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素3種蒽醌類成分含量的LC-MS法；并采用本法比較了灌胃給藥大黃生品/酒制品提取物后3種蒽醌類成分在體內(nèi)組織分布的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，灌胃給予大鼠大黃生品/酒制品提取物后，蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素在動(dòng)物體內(nèi)分布迅速，且蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素不能透過(guò)血腦屏障。同時(shí)大黃酒制后各成分在心與肺組織中的分布增加，在肝和腎中的分布與生品組相比變化不大甚至有較小幅度降低。前期大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大黃酒制后有助于促進(jìn)蘆薈大黃素和大黃素的吸收，其生物利用度增加，體內(nèi)代謝較快，大黃酸的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)變化不大[15]，提示酒制對(duì)大黃物質(zhì)基礎(chǔ)有一定影響，從而影響有效成分的組織分布。傳統(tǒng)中藥炮制理論認(rèn)為，藥物酒制后有升提作用。本實(shí)驗(yàn)為臨床應(yīng)用酒大黃治療上焦病癥，如目赤腫痛，口舌生瘡等疾病提供了科學(xué)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較大黃酒制前后游離蒽醌在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)和組織分布，為大黃酒制機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 深入炮制機(jī)制和藥效研究，探明中藥炮制改變藥性的科學(xué)內(nèi)涵變化規(guī)律，闡明飲片的炮制原理，豐富了中藥藥性理論的科學(xué)內(nèi)涵，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯 曹陽(yáng)陽(yáng)]