高效液相法測定牛奶中4-硝基咪唑抗生素殘留

劉奇琳，黃祥暉，廖素蘭

(武夷學院茶與食品學院，福建武夷山354300)

高效液相法測定牛奶中4-硝基咪唑抗生素殘留

劉奇琳，黃祥暉，廖素蘭

(武夷學院茶與食品學院，福建武夷山354300)

建立了一種分子印跡固相萃取（MISPE）-高效液相色譜法同時測定奶粉中4-硝基咪唑抗生素殘留的方法，樣品經自制磁性分子印跡聚合物富集凈化、酸性甲醇-水(9∶1,體積比)洗脫后，用高效液相-紫外檢測器測定。檢測波長320 nm，色譜柱溫39℃，流動相為乙腈-1.0%乙酸/水（體積比），線性范圍為20～5 000μg/L，檢測限為3.71μg/L，應用此方法對實際奶粉樣品中4-硝基咪唑抗生素測定，89.4%～96.6%，相對標準偏差小于10%。該方法具有操作簡單便捷、快速、靈敏高效等優點，可滿足實際工作的需要。

高效液相；4-硝基咪唑；抗生素；奶粉

硝基咪唑類藥物(nitroimidazoles)是一類有硝基咪唑環結構的藥物，因為其具有獨特的抗菌抗原蟲作用，在畜禽等動物養殖領域被較普遍地使用。因其潛在的致畸和致癌性，已經被國際上許多國家列入違禁藥物名單[1-3]，也被歐盟規定禁止用于食用動物。2002年美國食品與藥物管理局(FDA)公布了禁止使用的抗生素名單中就有包括多種硝基咪唑化合物。在我國，農業部和國家藥品監督管理局也規定硝基咪唑類藥物及其鹽、酯及制劑不準添加入動物飼料中，也不允許在食品中使用[4]。

目前，硝基咪唑類抗生素的常用檢測方法主要有氣相色譜法[5]、液相色譜法[6-12]及免疫分析法[13]等。氣相色譜法需衍生，免疫法的檢測項目有限，質譜法儀器昂貴。由于在實際樣品中硝基咪唑的含量很低且基質的成分復雜，因此在檢測之前通常需要對實際樣品進行預富集處理。固相萃取（solid phase extraction，SPE）是目前比較常用的預富集方法[14-15]，它具有操作簡便快速、溶劑用量少等特點。磁性分子印跡聚合物（MMIP）結合了磁性和分子印跡聚合物的優點；采用MMIP固相萃取高效液相紫外（HPLC-UV）測定動物源性食品奶粉中4-硝基咪唑藥物殘留量；探索簡單快捷、靈敏、成本低，可以用來快速檢測4-硝基咪唑抗生素的殘留。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260 LC（配備紫外檢測器，二元泵、脫氣泵、色譜工作站）、自動進樣器和柱溫箱，美國安捷倫公司；C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；超聲清洗器：上海躍進醫用光學器械廠；水浴恒溫搖床：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；pH計：哈納沃德儀器有限公司；干燥烘箱：上海精宏實驗設備有限公司；分析天平。

4-硝基咪唑（4-nitroimidazole，4-NMZ）標準品，百靈威科技有限公司；乙腈，色譜純，Sigma公司；氯化鈉，冰醋酸，分析純，西隴化工股份有限公司；純凈水，娃哈哈；甲醇，分析純，廣東光華科技股份有限公司；鹽酸，分析純，天津市北方天醫化學試劑廠；檸檬酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉，分析純，上海展云化工有限公司；有機相針式濾膜、一次性有機相針式過濾器，天津市津騰實驗設備有限公司；一次性無菌注射器，山東新華安得醫療用品有限公司；硝唑磁性分子印跡聚合物。

1.2 溶液的配制

0.1 mol/L檸檬酸-McIlvaine緩沖液：將21 g檸檬酸溶于水，并定容到1 L；將1 L的0.1 mol/L檸檬酸和625 mL 0.2 mol/L磷酸二氫鈉混合均勻（調節pH到5）。

準確稱取4-NMZ 50.0 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL，配制成質量濃度為1.0 mg/mL的標準儲備液，放置4℃冰箱中避光保存。臨用時取標準儲備液，配制成一系列質量濃度的混合標準液。

1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動相：乙腈-1%乙酸水溶液；流動相流速：1mL/min；柱溫：39℃；進樣量：8μL；紫外檢測波長：320 nm；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradient elution

1.4 標準曲線及定量參數

用流動相溶液將硝基咪唑標準工作液稀釋成20～5 000μg/L系列濃度的混合工作液，如前所述的色譜條件對混合標準工作液依次進樣3次，分別以各種物質的質量濃度C(μg/L)對峰面積A進行線性回歸分析。并測定檢出限(instrument detection limit，IDL)。

1.5 樣品前處理方法

將100mg MMIPs加入到燒杯中，分別用5mL甲醇、去離子水活化；取5 mL乙腈奶樣加入20mL純凈水和20mL檸檬酸-Mcllvaine緩沖溶液，混合后在25℃，300 r/min振蕩萃取，再與活化的MMIPs混合，以300 r/min的轉速在25℃條件下振蕩；提取完成后，磁場分離；加入90%甲醇水溶液（pH=2）3mL洗滌MMIPs；磁場分離，收集洗脫液，用0.45μm濾膜過濾，待測。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇

對4-硝基咪唑抗生素進行紫外全波長掃描，結果顯示其在310～320 nm范圍內有最大紫外吸收波長，因此選擇320 nm的波長檢測。

2.1.2 流動相的選擇

試用了乙腈-1.0%乙酸水溶液作為流動相，發現分離效果較好。酸性條件下硝基咪唑類藥物呈離子狀態，便于分離，峰型尖銳，峰型較好，改變出峰時間，改善峰型前沿和抑制拖尾的現象，提高了分離度。通常流動相乙酸的濃度對目標物質的保留有很大的影響。考察了0.5%、0.8%、1.0%以及1.2%的乙酸對4-硝基咪唑色譜保留的影響，實驗結果發現隨著乙酸濃度的增加，4-硝基咪唑出峰時間縮短；考慮到色譜柱使用壽命，不宜使用過低的pH溶液，選擇1.0%為實驗流動相濃度。

2.1.3 柱溫的選擇

改變柱溫，對色譜保留造成一定的影響。考察了不同柱溫（37、38、39、40、41℃）對色譜保留的影響，綜合考慮39℃時色譜保留較為理想，因此選擇39℃為實驗柱溫。

2.1.4 流速的選擇

提高流速可以加快物質的出峰速度，降低流速會延長出峰時間、降低柱效。改變流速對目標物質的保留有一定作用。一般用來對色譜圖做精細調節。

在其他最優色譜條件下考察了0.8、0.9、1.0、1.1、

1.2 mL/min這5個流速對4種抗生素的分離效果，發現實驗范圍內的流速混合標準液均能完全分離，隨著流速的增加，混合標準液的分離時間縮短。綜合考慮流速為1mL/min時的效果最為理想，柱子壓力小。

2.1.5 標準溶液色譜圖

綜合上述因素，最終采用1%乙酸/水（體積比）為流動相，采用梯度洗脫程序，實現了4 min內4-硝基咪唑快速分離檢測，標準色譜圖如圖1所示，峰形尖銳，峰對稱性好。

圖1 4-硝基咪唑抗生素標準溶液色譜圖Figure 1 4-nitro imidazole antibiotic standard solution chromatograms

2.2 標準曲線的線性范圍、檢出限、精密度

定量采用外標法，所得標準曲線和相關參數見表2。從表中可知，4-硝基咪唑抗生素在20～5 000μg/L濃度范圍內具有極好的線性，相關系數R2為0.999 99。經測定標樣的檢出限為3.71μg/L，相對標準偏差3.2%。

表2 標準曲線和相關參數Table 2 Standard curve and calibration parameters

2.3 實際牛奶粉樣品的測定

采用磁分散固相萃取-HPLC方法對實際奶粉樣品中的4種硝基咪唑抗生素殘留進行檢測，奶粉中均未檢出這4種物質，實際奶粉樣品測定色譜圖見圖2。對實際奶粉樣品的加標回收率為89.4%～96.6%，相對標準偏差小于10%。加標奶粉樣品色譜圖見圖3。實際奶粉樣品測定的前處理過程中采用90%的甲醇水溶液（pH=2）3.0 mL洗滌MMIPs，洗脫液未經氮氣吹干和進一步濃縮，簡化了前處理步驟，節約了時間與成本。

圖2 空白奶粉樣品色譜圖Figure 2 Blank milk powder sample chromatograms

圖3 加標奶粉樣品色譜圖Figure 3 Add themilk powder sample chromatograms

表3 4-硝基咪唑抗生素在奶粉中的平均回收率及精密度Table 3 The recovery and RSD of 4-NMZ standard addition for realmilk power samples

3 結論

建立了一種磁性固相微萃取-HPLC法同時測定奶粉中4-硝基咪唑抗生素的方法，該方法對奶粉中的4-NMZ的回收率進行測定，回收率89.4%～96.6%,相對標準偏差小于10%。證明建立的方法可對奶粉中的硝基咪唑藥物進行檢測，且具有簡便、成本低、較高的特異性和靈敏性。

參考文獻：

[1]MUDRY M,CARBALLO M,DE V M,et al.Mutagenic bioassay of certain pharmacological drugs：III.Metronidazole (MIZ)[J].Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms ofMutagenesis,1994,305(2)：127-132.

[2]CAVALIERE A,BACCIM,AMOROSIA,et al.Induction of lung tumors and lymphomas in BALB/c mice by metronidazole[J].Tumori,1983,69(5)：379-382.

[3]POLZER J,GOWIK P.Validation of a method for the detection and confirmation of nitroimidazoles and corresponding hydroxylmetabolites in turkey and swinemuscle bymeans of gas chromatography-negative ion chemical ionization mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B：Bimedical Sciences and Applications,2001,761(1)：47-60

[4]黎翠玉,吳敏,嚴麗娟,等.高效液相色譜-串聯質譜測定動物源性食品中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留量[J].食品安全質量檢測學報,2012（1）：17-22.

[5]NEWKIRK D,RIGHTER H,SCHENCK F,et al.Gas chromatographic determination of incurred dimetridazole residues in swine tissues[J].Journal-Association of Official Analytical Chemists,1989,73(5)：702-704.

[6]SEMENIUK S,POSYNIAK A,NIEDIELSKA J.Determination of nitroimidazole residues in poultry tissues,serum and eggs by high-performance liquid chromatography[J].Biomed Chromatogr,1995,9(5)：238-242.

[7]張鴻偉,簡慧敏,林黎明,等.液相色譜-四極桿/離子阱質譜快速測定蜂蜜中痕量硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留[J].分析測試學報,2012（7）：763-770.

[8]張璐,孔祥虹,王菡,等.在線凈化-超高效液相色譜同位素稀釋串聯質譜法檢測蜂蜜中硝基咪唑類及其代謝物的殘留[J].分析化學,2014（12）：1735-1742.

[9]張璐,孔祥虹,何強,等.超高效液相色譜-串聯質譜聯用法對奶粉中3種硝基咪唑殘留物的測定[J].分析測試學報, 2010（3）：306-309.

[10]何強,孔祥虹,李建華,等.超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定蜂蜜中硝基咪唑類、磺胺類、喹諾酮類獸藥殘留[J].分析試驗室,2010（8）：61-65.

[11]王揚,鄭重鶯,何豐,等.高效液相色譜法測定羅非魚肌肉中硝基咪唑類多組分殘留量[J].食品科學,2011（20）：197-199.

[12]陳瑞春,艾連峰,郭春海,等.液相色譜同位素稀釋串聯質譜法測定牛奶和奶粉中3種硝基咪唑類禁用獸藥及其代謝物的殘留量[J].中國食品衛生雜志,2011（6）：543-549.

[13]STANKER LH,MCKEON C,WATKINSB E,etal.Detection of dimetridazole and other nitroimidazole residues in turkey using an immunoassy[J].Journal Agriculture and Food Chemistry,1993,41(5)：1332-1336.

[14]STUBBINGSG,TARBIN J,COOPER A,et al.A multiresidue cation-exchange clean up procedure for basic drugs in produce of animal origin[J].Analytica Chimica Acta, 2005,547(2)：262-268.

[15]高小龍，王大菊，汪紀倉,等.蜂產品中硝基咪唑類藥物殘留高效液相色譜研究[J].湖北大學學報(自然科學版)，2008, 30(1)：71-75.

（責任編輯：葉麗娜）

Determ ination of 4-Nitroim idazole Antibiotic in M ilk Sam ples Using High Performance Liquid Chromatography

LIU Qilin,HUANG Xianghui,LIAO Sulan
(School of Tea and Food Science,Wuyi University,Wuyishan,Fujian 354300)

Amolecularly imprinted solid-phaseextraction(MISPE)-high performance liquid chromatography(HPLC)method hasbeen developed for determination of4-nitroimidazole antibiotic inmilk power．The analyteswere firstenriched and purified through amagnetic MISPE，and elutedwith acidmethanol-watersolution(9∶1，V/V),then detected by a HPLCwith a UV detector．The detectionwavelengthwas320 nm and the column temperaturewas39℃，usinggradientelution processwith acetonitrile-1.0%aceticacid/water(V/V)as themobilephase．The linearity rangewas 20～5 000μg/L,the limitof detection was 3.71μg/L．The recovery ranges of standard addition for realmilk power sampleswere 89.4%～96.6%，RSD less than 10%．Proving thismethod iseasy,rapid,sensitiveand efficienttomeettheneedsofactualwork．

high performance liquid chromatography(HPLC);nitroimidazoles;antibiotics;milk power

O657.72

A

1674－2109(2017)03－0017－04

2016-12-30

國家自然科學基金項目（201407118）；武夷學院科技項目（XL201303）。

劉奇琳（1974-），男，漢族，講師，主要從事化學工程食品安全的研究。