香水百合試管鱗莖形成與增殖條件優(yōu)化研究

楊鷺生，陳曉敏，戚卉，李娟，李國(guó)平

（武夷學(xué)院生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建武夷山354300）

香水百合試管鱗莖形成與增殖條件優(yōu)化研究

楊鷺生，陳曉敏，戚卉，李娟，李國(guó)平

（武夷學(xué)院生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建武夷山354300）

為探索香水百合試管鱗莖誘導(dǎo)與增殖的適宜培養(yǎng)條件，以其鱗片為外植體，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究了蔗糖、噻苯?。═DZ）、烯效唑（S3307）、二氯苯氧乙酸（2,4-D）等因素對(duì)試管小鱗莖形成的影響，結(jié)果表明：誘導(dǎo)香水百合試管小鱗莖形成的最優(yōu)培養(yǎng)基是MS+1.5 mg/L TDZ+2mg/L S3307+0.2mg/L 2,4-D+60 g/L蔗糖；添加一定濃度的PP333可以促進(jìn)小鱗莖的增殖生長(zhǎng)，適宜試管鱗莖增殖的培養(yǎng)基為MS+10mg/L PP333。

香水百合；鱗莖；組織培養(yǎng)；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

香水百合（Lilium casablanca）為百合科百合屬東方百合（Lilium oriental）雜交種系，其花朵頭較大，花色秀麗，氣味芬芳宜人，一直深受消費(fèi)者的青睞。百合傳統(tǒng)的繁殖方法是靠鱗莖分株方式進(jìn)行繁殖，種球易受病毒侵染而致品質(zhì)下降。應(yīng)用植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)為百合脫毒種苗的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)提供了一條有效途徑[1]。百合鱗片離體培養(yǎng)中有試管內(nèi)結(jié)小鱗莖現(xiàn)象，已有一些研究探討了試管鱗莖形成機(jī)理和影響因素[2-5]，但其結(jié)果因品種和培養(yǎng)條件不同而有所差異[6-7]。關(guān)于香水百合的組織培養(yǎng)再生體系已有些研究報(bào)道[8-10]，影響百合試管鱗莖形成的主要因素有外植體種類(lèi)、基本培養(yǎng)基、蔗糖濃度和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)及配比等。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法是一種多因素的試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，可研究多個(gè)因素對(duì)指標(biāo)的效應(yīng)，分析出各因素對(duì)指標(biāo)的影響程度，以實(shí)現(xiàn)工藝的優(yōu)化。在前人工作基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法研究蔗糖、噻苯?。═DZ）、烯效唑（S3307）、二氯苯氧乙酸（2,4-D）等因素對(duì)試管小鱗莖形成的影響，初步篩選和優(yōu)化適宜香水百合試管鱗莖形成的培養(yǎng)基，為實(shí)現(xiàn)香水百合試管種球快速繁殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

市售健壯飽滿(mǎn)的香水百合(Lilium casablanca)鱗莖，取其鱗片中層部位為外植體。

1.2 試劑

6-芐氨基嘌呤（6-BA）、α-萘乙酸（NAA）、二氯苯氧乙酸（2,4-D）、噻苯?。═DZ）、烯效唑（S3307）、多效唑（PP333）、70%酒精，0.1%升汞、無(wú)菌水等。以上植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑均為分析純級(jí)試劑。

1.3 方法

外植體預(yù)處理：將香水百合種球的鱗片掰開(kāi)，先用流水沖洗1 h，然后用0.1%KMnO4溶液浸泡10min，再用流水沖洗，直到KMnO4的顏色完全被沖洗掉。

外植體滅菌與接種：在超凈臺(tái)無(wú)菌條件下，外植體用70%的酒精浸泡30 s，用無(wú)菌水沖洗2次，然后用0.1%升汞浸泡10min，再用無(wú)菌水沖洗4～5次，取中部鱗片切成1 cm×1 cm大小后,接種于不同培養(yǎng)基中。

試管小鱗莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)：以MS+0.1mg/L NAA+ 0.8%瓊脂（pH=5.8）為基本培養(yǎng)基，選取蔗糖、TDZ、S3307、2,4-D 4種因素處理，每種因素取4個(gè)水平（表1），采用L16(45)正交設(shè)計(jì)表（表2），共16組處理，考察蔗糖濃度和3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)香水百合愈傷組織誘導(dǎo)的影響。每種處理接種20瓶，每瓶接種外植體3～4塊。接種后先進(jìn)行暗培養(yǎng)10 d，后置培養(yǎng)室光下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx，14 h/d，培養(yǎng)溫度(25+2)°C。每隔10 d觀察外植體變化并記錄，60 d后統(tǒng)計(jì)各處理每塊外植體形成的小鱗莖數(shù)，其中平均小鱗莖數(shù)=目測(cè)形態(tài)正常的小鱗莖數(shù)/接種外植體數(shù)。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 2 Orthogonal experimental design

試管小鱗莖增殖培養(yǎng)：將誘導(dǎo)形成的試管小鱗莖分割為小塊，接種于添加不同濃度PP333的培養(yǎng)基上（表3），以考察PP333對(duì)香水百合試管鱗莖增殖的影響。每種培養(yǎng)基均添加蔗糖60 g/L，瓊脂濃度為8 g/L（pH=5.8）。每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接3～4塊外植體，光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上述試管鱗莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)。30天后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)，其中增殖系數(shù)=（增殖形成的小鱗莖數(shù)/接種數(shù)）×100%。

表3 小鱗莖增殖培養(yǎng)基配方Table 3 Media for lily bulblet propagation

2 結(jié)果與分析

2.1 香水百合試管小鱗莖誘導(dǎo)的優(yōu)化

通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察了不同濃度TDZ、S3307、2,4-D和蔗糖配比處理對(duì)香水百合試管小鱗莖形成的影響，正交試驗(yàn)結(jié)果如表4。4個(gè)因素對(duì)試管小鱗莖的形成有不同程度的影響，各因素不同水平之間的影響大小也存在差異。由表5中極差分析結(jié)果可知，蔗糖濃度對(duì)誘導(dǎo)香水百合試管小鱗莖形成的影響最大，4個(gè)因素對(duì)試管小鱗莖形成的影響大小順序?yàn)椋赫崽恰?,4-D〉S3307〉TDZ。根據(jù)k值大小，初步篩選到適宜香水百合試管小鱗莖誘導(dǎo)形成的最佳培養(yǎng)基配方，即MS+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L 2,4-D+2 mg/L SS3307+ 1.5mg/L TDZ+60 g/L蔗糖+0.8%瓊脂（pH=5.8）。在此培養(yǎng)基中（8號(hào)處理），平均每個(gè)外植體可產(chǎn)生6.25個(gè)小鱗莖（見(jiàn)圖1、圖2）。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The results of the orthogonal experiment

表5 極差分析結(jié)果Table 5 The results of range analysis

圖1 示香水百合鱗片上形成的小鱗莖Figure 1 The bulblet forming on lily scales

圖2 最優(yōu)培養(yǎng)基中形成密集的試管小鱗莖Figure 2 Intensive test-tube bulbs forming in the optimal culturemedium

2.2 香水百合試管小鱗莖增殖培養(yǎng)

分析不同濃度PP333對(duì)香水百合試管小鱗莖增殖影響（表6），試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加一定濃度PP333可以促進(jìn)試管小鱗莖的增殖，PP333的溶度為10 mg/L時(shí)增殖率最高，增殖系數(shù)達(dá)5.65，但溶度為15 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)較對(duì)照處理（培養(yǎng)基編號(hào)1）的小，說(shuō)明PP333溶度過(guò)高會(huì)抑制小鱗莖的分化。

表6 不同濃度PP333對(duì)香水百合小鱗莖增殖影響Table 6 Effects of different concentration of PP333on lily bulblet propagation

圖3 小鱗莖切塊剛接入增殖培養(yǎng)基情況Figure3 Showing thesinglebulbletinoculated on culturemedium

圖1至圖6示在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中形成的叢生小鱗莖被切割單離后可在增殖培養(yǎng)基中繼代增殖，繼續(xù)培養(yǎng)可分化出形態(tài)正常的葉和根，進(jìn)而形成完整的試管苗。

圖4 示增殖培養(yǎng)基3中小鱗莖增殖情況Figure 4 The propagation of bulbleton themedium No.3

圖5 示小鱗莖上分化出葉Figure 5 Showing the leaf differentiation on bulblets

圖6 示由小鱗莖發(fā)育形成的試管苗Figure 6 Plantlets formation via bulblets

3 討論與結(jié)論

在百合的組織培養(yǎng)中，其花器官、葉片、莖段、芽尖、珠芽、鱗片和種子等器官均可作為外植體建立植株再生體系，但是以鱗片為外植體，通過(guò)誘導(dǎo)形成試管小鱗莖的研究最為廣泛[11]。影響試管鱗莖形成的因素很多，一些研究表明鱗片的部位、低溫處理、培養(yǎng)條件、基本培養(yǎng)基種類(lèi)、蔗糖濃度和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)、濃度配比等因子都對(duì)試管鱗莖的誘導(dǎo)和增殖有顯著影響[12-13]。培養(yǎng)基中添加的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑成分、濃度和不同配比對(duì)百合小鱗莖增殖起關(guān)鍵作用，應(yīng)用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑主要有6-BA、KT、NAA、ZT、2,4-D、IAA、IBA等[14]。

蔗糖是培養(yǎng)基中的重要組成部分，主要起提供能源物質(zhì)和調(diào)節(jié)滲透壓的作用。陳彥云等[15]研究表明，2%的蔗糖濃度時(shí)玻璃化苗多，不利于分化，濃度為3.5%蔗糖適宜麝香百合鱗片芽的誘導(dǎo),濃度為6.5%蔗糖適宜于繼代培養(yǎng)，促進(jìn)試管鱗莖的生長(zhǎng)。TDZ具有細(xì)胞生長(zhǎng)素和細(xì)胞分類(lèi)素這雙重活性，TDZ在亞洲百合試管苗葉片分化、東方百合生長(zhǎng)點(diǎn)的愈傷組織誘導(dǎo)、宜昌百合體胚誘導(dǎo)體系中，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[16-17]。付文奇等[7]研究表明，MS培養(yǎng)基中添加一定濃度2,4-D對(duì)誘導(dǎo)東方百合葉片形成愈傷組織有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。張彥妮等[18]在研究毛百合試管鱗莖形成和膨大的培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)低濃度多效唑（PP333）顯著促進(jìn)小鱗莖膨大生長(zhǎng)，并有利于誘導(dǎo)生根及試管苗生長(zhǎng)。多效唑和烯效唑均是三唑類(lèi)植物生長(zhǎng)延緩劑，作用機(jī)制相似，但烯效唑的活性比多效唑高[19]。

基于上述分析，本研究選擇蔗糖、TDZ、S3307、2,4-D這4種因素，通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出對(duì)香水百合試管鱗莖形成培養(yǎng)的最優(yōu)濃度組合，即MS+0.1mg/L NAA+0.2 mg/L 2,4-D+2 mg/L S3307+1.5 mg/L TDZ+ 60 g/L蔗糖+0.8%瓊脂（pH 5.8），4個(gè)因素中蔗糖濃度對(duì)試管小鱗莖形成的影響最大，與前人的研究結(jié)果相似。試管小鱗莖增殖培養(yǎng)結(jié)果表明，在一定的范圍中，PP333可以顯著促進(jìn)小鱗莖增殖，PP333的溶度為10 mg/L時(shí)增殖率最高。

[1]徐品三,劉華夏.無(wú)病毒百合組培種球快速繁殖體系的建立[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2009,25(9)：174-178.

[2]張潔,蔡宣梅,林真,等.百合試管鱗莖誘導(dǎo)及膨大技術(shù)的研究[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2010,25(3)：328-331.

[3]傅玉蘭,何風(fēng)群.影響百合試管鱗莖增殖因素的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,28(2)：179-181.

[4]朱志國(guó).影響百合試管鱗莖增殖因素的研究[J].熱帶作物學(xué)報(bào),2013,34(10)：1961-1965.

[5]王愛(ài)勤,周歧偉,何龍飛,等.百合試管結(jié)鱗莖的研究[J].廣西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1998,17(1)：71-75.

[6]鄭一強(qiáng),孫紅梅.東方百合試管鱗莖形成條件優(yōu)化[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2011,27(6)：90-94.

[7]付文奇,杜雙田,陳建科,等.NAA和2,4-D對(duì)東方百合組織培養(yǎng)的影響[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào),2008,23(2)：83-86.

[8]阮少寧,楊華,梁一池,等.香水百合組織培養(yǎng)的試驗(yàn)研究[J].福建林學(xué)院學(xué)報(bào),2001,21(2)：142-145.

[9]李冰華,金曉玲,劉雪梅.香水百合鱗片組織培養(yǎng)再生體系的建立[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2008(4)：83-85.

[10]蘇琛.香水百合再生體系的建立[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012, 40(7)：3906-3907.

[11]蔣細(xì)旺,司懷軍.百合的組織培養(yǎng)技術(shù)綜述[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2004(1)：78-82.

[12]潘佑找,柯尊濤,趙宇瑛.不同外植體對(duì)蘭州百合組織培養(yǎng)的影響[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2007,13(19)：242-245.

[13]周玲云，高素萍，陳鋒.蔗糖和光周期在瀘定百合試管鱗莖膨大中的作用機(jī)制[J].2016,42(4)：435-441.

[14]李筱帆,張啟翔.百合組織培養(yǎng)和植株再生的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(4)：1479-1482.

[15]陳彥云.麝香百合組培快速繁殖技術(shù)研究[J].寧夏大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2001,22(1)：67-69.

[16]張藝萍,吳麗芳,吳學(xué)尉,等.東方百合胚性愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2008(12)：33-36.

[17]孫安妮,張延龍,牛立新,等.宜昌百合體細(xì)胞胚誘導(dǎo)及植株再生[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011(8)：142-146.

[18]張彥妮,李兆婷,張艷波,等.毛百合試管鱗莖形成和膨大的培養(yǎng)優(yōu)化[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,44(4)：74-78.

[19]李寧毅,劉冰.植物生長(zhǎng)延緩劑S-3307對(duì)百合生長(zhǎng)發(fā)育和內(nèi)源激素的影響及相關(guān)性分析[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2010,19 (5)：153-156.

（責(zé)任編輯：葉麗娜）

Culture Condition Optim ization of Test Tube-bulb Formation and Propagation of Lilium casablanca

YANG Lusheng,CHEN Xiaoming,QIHui,LIJuan,LIGuoping
（School of Ecology and Resource Engineering,Wuyi University,Wuyishan,Fujian 354300）

To find out optimizing culture conditions for test-bulb formation and propagation of Lilium casablanca,the effects of TDZ, S3307,2,4-D and sucrose in different concentration on the test-tube bulb induction and formation were studied with orthogonal test design, taking lily scales as explants.The results showed that the optimal culturemedium for bulblet induction was MS+1.5 mg/L TDZ+2 mg/L S3307+0.2 mg/L 2,4-D+60 g/L sugar.A certain concentration of PP333added in MSmedium promoted the growth and proliferation of lily bulblets,and the optimalmedium for bulblet propagation was MS+10mg/L PP333.

Lilium casablanca;bulb;tissue culture;orthogonal design

S 723.132

A

1674－2109(2017)03－0001－05

2016-09-27

福建省科技創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(2013N2009）；福建省科技廳戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)重點(diǎn)項(xiàng)目(2014N0030）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201410397006、201610397006)。

楊鷺生(1964-)，女，漢族，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事生物資源開(kāi)發(fā)與利用研究。

通迅作者：李國(guó)平（1966-），男，漢族，教授，主要從事植物種質(zhì)資源與開(kāi)發(fā)利用研究。