蒸發光散射法測定重組人生長激素注射液中泊洛沙姆188含量

文/陸春燕 董世建 許 培 李增禮 王榮海（安徽安科生物工程<集團>股份有限公司）

生長激素是垂體前葉分泌的一種單鏈肽類激素。上世紀60年代，尸源性生長激素已開始用于治療生長激素缺乏的患者；1985年，美國食品藥品監督管理局（FDA）批準重組人生長激素（rhGH）用于治療兒童生長激素缺乏癥（GHD）；此后20 多年，FDA 陸續批準重組人生長激素用于治療慢性腎功能不全、HIV 感染相關性衰竭綜合癥、Turner 綜合癥、成人生長激素缺乏癥、Prader-Willi 綜合癥、小于胎兒齡、特發性矮身材、短腸綜合癥等11 種適應癥[1,2]。隨著臨床研究不斷深入，rhGH 的應用范圍不再局限于FDA 批準的適應癥，其在神經系統疾病如缺血缺氧性腦病、腦外傷、腦性癱瘓、阿爾茨海默病以及燒傷領域、輔助生殖等方面均有一定的臨床意義[3]。

泊洛沙姆188，一種高分子非離子表面活性劑，是優良的藥物制劑新輔料，無毒，對皮膚黏膜無刺激、無過敏性，對人體十分安全，現已廣泛應用于制藥工業，主要作乳化劑、穩定劑、增溶劑和分散劑[4]。本文研究的重組人生長激素注射液是本公司自主研發的一種重組蛋白藥物，目前已批準生產，其制劑處方中含有泊洛沙姆188。

隨著藥品質控標準的不斷完善，國家藥品審評中心對重組蛋白藥物中的藥用輔料含量的準確控制越來越關注，一般會要求企業建立分析方法對輔料含量進行控制。《中國藥典》2015年版中未記載泊洛沙姆188 含量測定方法[5]，文獻也鮮有報道泊洛沙姆的檢測方法。本著對藥用輔料含量的質控原則，本文建立了蒸發光散射檢測重組人生長激素注射液中泊洛沙姆188 含量的方法，并進行了較為系統的方法學驗證。

一、材料

1.主要材料和試劑

泊洛沙姆188，甘露醇，組氨酸，注射用水，重組人生長激素注射液，乙腈。

2.主要儀器設備

高效液相系統Waters2695，蒸發光散射檢測器Waters2424，Empower3 操作軟件，電子天平。

二、方法與結果

1.泊洛沙姆188 對照品貯備液和對照品溶液的配制

稱取泊洛沙姆188 對照品40mg，置于10mL 容量瓶中，用注射用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液；取對照品貯備液1mL，加3mL 注射用水稀釋，混勻即得對照品溶液。

2.色譜條件

以TSK gel G3000SWXL（7.8mm×300 mm，5μm）為色譜柱；以25%乙腈為流動相，流速0.6mL/min、柱溫25℃；樣品室溫度4℃；漂移管溫度60℃；氣體壓力0.193MPa；增益因子300，數據率1；進樣量30μL。

3.專屬性考察

分別取空白溶液（稀釋液）、陰性對照樣品（除不含泊洛沙姆188 外，其他組分與重組人生長激素注射液相同）、泊洛沙姆188 對照品溶液、重組人生長激素注射液，按前述色譜條件依次進樣，考察方法專屬性。泊洛沙姆188 對照品溶液和重組人生長激素注射液中均含目標峰，而空白溶液及陰性對照樣品在泊洛沙姆188 保留時間左右無吸收峰，可證實目標峰（保留時間14.373min）為泊洛沙姆188。其峰形良好，與相鄰峰（甘露醇）分離度良好，且無其他色譜峰干擾測定，表明本方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

圖1 空白（A）、陰性對照樣品（B）、泊洛沙姆188 對照品（C）和重組人生長激素注射液（D）的色譜圖

4.系統重復性

精密量取泊洛沙姆188 對照品溶液，按照前述色譜條件連續進樣6 次，計算泊洛沙姆188 色譜峰保留時間和面積的，結果分別為0.10%和0.70%，表明儀器系統重復性良好。

5.線性范圍考察

取泊洛沙姆188 對照品貯備液，用注射用水稀釋分別 制成系列濃度為1.6mg/mL、1.4mg/mL、1.2mg/mL、1.0mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL，按前述色譜條件分別進樣測定。以泊洛沙姆188 對照品濃度的常用對數（）為橫坐標，峰面積的常用對數（）為縱坐標，進行線性回歸，確定線性范圍。回歸方程為=1.2978+3.3759，2=0.9989，表明泊洛沙姆188 在質量濃度0.2～1.6mg/mL 范圍內，線性關系良好。

6.精密度（重復性）

取同一批次重組人生長激素注射液6 支，用注射用水3 倍稀釋后，按前述色譜條件分別進樣測定，計算泊洛沙姆188 色譜峰保留時間和面積的，結果分別為0.06%和0.74%，精密度良好。

7.準確度

分別取泊洛沙姆188 對照品儲備液0.4mL、0.5mL、0.6mL 各3 份，置于2mL 容量瓶中，加適量重組人生長激素藥液后，用注射用水定容至刻度，搖勻，制成泊洛沙姆188 濃度分別為0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL 的溶液（相當于供試品中泊洛沙姆188 含量80%、100%、120%的重組人生長激素供試品溶液）各3 份，按照前述色譜條件分別進樣測定，考察低、中、高3 個濃度的回收率。3 個不同質量濃度的泊洛沙姆188 的回收率分別為99.91%、99.93%和101.38%。

8.耐用性試驗

改變流速。將色譜條件中的流速分別設定為0.54mL/min、0.6mL/min、0.66mL/min，其余色譜條件不變，分別進樣，外標法測定供試品中泊洛沙姆188 含量，考察流速對測定供試品中泊洛沙姆188 含量的影響。結果顯示，同一供試品在3 種不同流速下，含量測定結果為0.48%。

改變載氣壓力。將色譜條件中的載氣壓力分別設定為0.172MPa、0.193MPa、0.214MPa，其余色譜條件不變，分別進樣，外標法測定供試品中泊洛沙姆188 含量，考察載氣壓力對測定供試品中泊洛沙姆188 含量的影響。結果顯示，同一供試品在3 種不同載氣壓力下，含量測定結果為0.21%。

改變漂移管溫度。將色譜條件中的漂移管溫度分別設定為54℃、60℃、66℃，其余色譜條件不變，分別進樣，外標法測定供試品中泊洛沙姆188 含量，考察漂移管溫度對測定供試品中泊洛沙姆188 含量的影響。結果顯示，同一供試品在3 種不同漂移管溫度下，含量測定結果為0.43%。

9.重組人生長激素注射液中泊洛沙姆188 含量測定結果

按照上述蒸發光散射—高效液相方法，測定3 批重組人生長激素注射液中泊洛沙姆188 含量，結果分別為標示量的95.67%、95.67%和95.00%，符合標準規定中規定的泊洛沙姆188 含量應為標示量的90.0%～110.0%。

三、結論

重組人生長激素注射液是一種重組蛋白藥物，其中的輔料泊洛沙姆188 無紫外吸收，所以選擇蒸發光散射檢測器檢測。本實驗參考徐佳茗等的文獻[6]，基于高效液相技術采用蒸發光檢測器，通過較為全面的方法學驗證，建立了重組人生長激素注射液中泊洛沙姆188 的含量測定方法。驗證結果表明，空白溶液對測定無干擾，泊洛沙姆188 峰能夠與重組人生長激素注射液中其他組分峰完全分離；系統重復性及樣品測定精密度良好；泊洛沙姆188 在質量濃度0.2～1.6mg/mL 范圍內線性關系良好（2=0.9989）；低、中、高3 個不同質量濃度的泊洛沙姆188的回收率分別為99.91%、99.93%和101.38%；該色譜條件對流速、載氣壓力和漂移管溫度耐受性良好，可用于測定重組人生長激素注射液中泊洛沙姆188 的含量。該方法還可為其他重組蛋白藥物中泊洛沙姆188 的含量測定提供方法學參考，有利于質量控制。