柚皮黃酮的提取工藝及紅外光譜分析

余先純 +王向軍

摘要：采用微波聯合酶法提取柚皮黃酮，探討了微波功率、微波處理時間、酶解溫度、酶液用量、酶解時間和緩沖液pH值對黃酮提取率的影響，并通過正交試驗對提取工藝進行優化。紅外光譜分析顯示，提取物為典型的黃酮類化合物。正交試驗結果表明，在微波功率350 W、微波處理時間10 min、酶解時間90 min、酶液用量0.9%（m/m）、酶提取溫度 55 ℃ 和緩沖液pH值4.5的條件下，黃酮的提取率可達到5.93%。

關鍵詞：柚皮黃酮；微波處理；酶法；紅外光譜

中圖分類號： TS201.1文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）04-0137-03

柚皮是豐富廉價的果實廢棄物，其中除了含有豐富的芳香油、果膠、色素外，還有經濟價值很高的橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷等生物類黃酮物質[1]，柚皮中的黃酮具有抗氧化、抗菌、抗突變、抗腫瘤等多種作用，廣泛用于醫藥、食品及美容等行業[2]。傳統的提取方法多為溶劑提取法，但提取時間長、產品活性及純度低。而酶法提取技術與微波聯合提取法在許多方面發揮著獨特的優勢。其中酶法提取條件溫和、能耗低、無污染[3]，但提取速度慢。微波輔助提取是利用微波場的特性和優點來強化天然產物有效物質浸出的提取方法。它具有提取效率高、消耗溶劑少、提取時間短等優點[4]。因此，采用微波聯合酶法提取技術，可以在低溫環境下加速胞內物質溶出，節省提取時間、加快反應速率和提高產率。

目前，關于利用微波聯合酶法提取柚皮黃酮的研究報道還不多見。本研究以柚皮為原料，采用微波聯合酶法聯用技術提取柚皮黃酮，并利用正交試驗對提取工藝進行優化，以獲取最佳的提取工藝。

1材料與方法

1.1材料

柚皮從水果市場購得；纖維素酶，諾維信（中國）生物技術有限公司；蕓香苷標準樣品（美國Sigma公司）；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純。

FH102微型植物試樣粉碎機（湖北省黃驊市齊家務科學儀器廠）；SHZ-82數顯水浴恒溫振蕩器（江蘇科興電器有限公司）；MAS-Ⅱ型常壓微波合成/萃取反應工作站（上海新儀微波化學科技有限公司）；傅立葉變換紅外光譜儀（Varian 2000，中國）。

1.2方法[HT]

1.2.1柚皮預處理

用蒸餾水將柚皮洗凈后放入鼓風干燥箱，在80 ℃恒溫干燥3 h，再用微型植物試樣粉碎機破碎至60目。取柚皮粉末3.0 g，按1 ∶[KG-*3]18的料液比后置于常壓微波合成/萃取反應工作站，在設定的功率下處理一段時間后冷卻至40 ℃，得到預處理液。

1.2.2柚皮黃酮的提取

在預處理液中加入一定質量分數的纖維素酶，加入200 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液[5]，調節pH值后置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中，在一定的溫度下提取一定時間，再冰浴冷卻至常溫，然后減壓、抽濾，得到柚皮黃酮提取液。同時，采取在無微波輔助條件下進行的對比試驗。

1.2.3柚皮黃酮的分析

樣品總黃酮含量的測定參照參考文獻[6]方法進行。

黃酮提取率按照（1）式計算：

[JZ（]黃酮提取率=[SX（]總黃銅質量桔皮粉質量[SX）]×100%。[JZ）][JY]（1）

2結果與分析

2.1單因素試驗

在探索性試驗的基礎上，以柚皮黃酮的提取率為指標，采用單因素試驗，考察微波處理時間、微波功率、酶解溫度、酶液用量、酶解時間和緩沖液pH值對黃酮提取率的影響，以確定提取黃酮的最佳條件。

2.1.1微波處理時間和功率的影響

在酶解溫度55 ℃、酶液用量0.8%、酶解時間90 min和緩沖液pH值為4.5條件下，設置微波功率分別為200、250、300、350 W。由圖1可知，微波功率對黃酮提取率的影響很大，功率低時，黃酮提取率較低；隨著功率的升高，黃酮提取率不斷升高，但10 min后，功率為300 W的提取率與350 W的相接近，考慮到生產成本，將功率確定為300 W。同時，當功率為300 W時，10 min后，黃酮提取率增幅趨緩，隨著時間的延長，提取率曲線幾乎接近水平，這是因為微波加熱能使有液泡類的細胞瞬間膨脹破碎，使胞內物質釋放出來，在提取初期，時間越長，胞內物質釋放物越多[7]，黃酮的提取率也就越高，隨著時間的延長，胞內釋放物的含量逐步減少，黃酮提取率增加不明顯。故將微波處理時間確定為10 min。

2.1.2酶解溫度和酶液用量對提取率的影響

在微波功率300 W、微波處理時間10 min、酶解時間90 min和緩沖液pH值為4.5的條件下進行試驗，設置酶解溫度45、50、55、 60 ℃。由圖2可知，相同條件下，酶解溫度為55 ℃時提取率最高，因此在本試驗中選取55 ℃為酶法提取溫度。在55 ℃時，酶液用量低于0.8%時，隨著酶液用量的增加，柚皮黃酮提取率明顯增加，當酶液用量超過此值時，黃酮提取率增加緩慢。

2.1.3緩沖液pH值和酶解時間對提取率的影響

選取微波功率[KG*8]300[KG*3]W、微波處理時間[KG*8]10[KG*3]min、酶解溫度[KG*8]55[KG*3]℃[KG*8]及酶液

用量0.8%，考察不同酶解時間和緩沖液不同pH值對黃酮提取率的影響，由圖3可知，在酶解時間為90 min、緩沖液pH值約為4.5時，柚皮黃酮提取率較高，而pH值低于或超過 4.5 后提取率均較小。這可能是由于pH值約為4.5時酶的活性較好的緣故，因此確定pH值為4.5。隨著提取時間的延長，黃酮提取率逐漸增加，當酶解時間超過90 min后再延長提取時間，黃酮提取率降低，故選擇90 min作為酶解時間。

2.2正交試驗分析

為了使提取黃酮提取工藝更加科學和合理，在進行單因素試驗的基礎上，取提取液pH值為4.5，采用L16（45）多因素正交試驗對提取黃酮的微波功率、微波處理時間、酶解時間、酶液用量和酶提取溫度5個有重要影響的因素進行設計，見表1。

根據正交試驗結果顯示：影響黃酮提取率的因素順序為B>A>D>C>E，工藝的最佳組合為B2A4D2C2E2，即微波功率350 W、微波處理時間10 min、酶解時間90 min、酶液用量0.9%和酶提取溫度55 ℃。按上述最優條件追加3次試驗，提取柚皮黃酮的平均提取率為5.93%。而在其他工藝條件相同，但無微波的條件下，采用酶法提取法，黃酮的提取率僅為4.24%，酶解時間240 min。因此，可見微波有利于提高黃酮的提取率及加快提取速度。

2.3紅外光譜分析

由于天然黃酮類化合物母核上常含有烴氧基、甲氧基、異戊烯氧基和羥基等基團，其紅外光譜在3 100～3 460 cm-1、1 600～1 640 cm-1，以及1 372、1 242、1 058 cm-1的振動峰可代表黃酮類化合物的特征峰。

由圖4可知，柚皮黃酮紅外譜在3 390 cm-1附近有羥基締合形成寬而強的吸收峰，說明有大量的酚羥基或糖上的羥基存在；同時，在2 932、2 862、1 370 cm-1附近有較強的表征2-[CM（23*2]和3-的吸收峰出現，證明飽和碳上的氫較多；而在

1 740 cm-1 附近由酯羰基（C—O）引起的伸縮振動峰雖然較弱，但在1 646 cm-1附近仍然有羰基的伸縮振動峰出現；此外，在1 646、1 518～1 322 cm-1范圍內有若干表征苯環的吸收峰存在；且在1 320～1 158 cm-1有由羥基的彎曲振動引起的吸收峰出現；而在1 246和1 060 cm-1附近也出現了C—O—C 的反對稱和對稱伸縮振動峰；最后，在890～700 cm-1附近還出現了苯環上取代基位置引起的吸收峰。以上特征峰的出現，均說明提取物為典型的黃酮類化合物。

3結論與討論

采用微波輔助酶法提取柚皮黃酮，微波的使用有利于提高黃酮的提取量和加快提取速度，而酶法的使用可以降低較高溫度對黃酮生物活性的影響。微波的功率、微波處理時間、緩沖液的pH值以及提取溫度、時間和酶液用量等因素均對黃酮的提取量有較大影響。

在緩沖液pH值為4.5的情況下，經過正交試驗優化后的提取工藝條件為：微波功率350 W、微波處理時間10 min、酶解時間90 min、酶液用量0.9%和酶提取溫度55 ℃，柚皮黃酮的提取率可達5.93%。

紅外光譜分析顯示，采用本方法所得到的提取物為典型的黃酮類化合物。

參考文獻：

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