北疆早熟棉區棉花黃萎病病菌的生物學特性

惠慧 張學坤+趙建軍+艾尼江

摘要：為明確新疆北疆早熟棉區黃萎病病菌的菌落類型及培養特性，于棉花黃萎病發病高峰期采集北疆早熟棉區典型發病地的病株進行分離和鑒定，并測定其生物學特性。結果表明：所有供試菌株均為菌核型；25、20 ℃分別為菌絲生長、產孢的最適溫度，33 ℃時絕大部分菌株仍能緩慢生長，并產生少量孢子；pH值在4～9范圍內菌株均可生長，pH值在5～7范圍內菌株生長較快；6.25%的菌株致死溫度、時間為65 ℃、10 min，37.50%的菌株致死溫度、時間為60 ℃、10 min，56.25%的菌株致死溫度、時間為55 ℃、10 min。

關鍵詞：北疆；早熟棉區；棉花；黃萎病；生物學特性

中圖分類號： S435.621.2+4文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）04-0066-04

新疆是我國最大的優質商品棉生產基地，2012年該地區種植棉花面積為165萬hm2，棉花產量為308萬t，占全國總產量的比例首次超過50%，已連續20年實現棉花面積、單產、總產和調出量全國第一[1]。近年來，棉花黃萎病在新疆主要植棉區大范圍發生，發病程度中度及中度以上的病田占48.1%，重病田占 24.1%，嚴重威脅新疆棉花的可持續發展[2]。北疆棉區的黃萎病發生程度較南疆重[3]，由于北疆棉區雜交棉品種較少，自2013年開始從黃河流域棉區大量引入雜交棉種子，而黃河流域棉區落葉型黃萎病已普遍發生，導致新疆棉花落葉型黃萎病種群明顯增加[4]。目前，北疆棉區黃萎病發生面積不斷擴增、急性枯死型癥狀明顯增加，生長中后期有些棉田甚至絕產，這主要與黃萎病擴展迅速且黃萎病病菌易受環境影響產生新的致病類型、土壤中病原菌的逐年累積、強致病力類型菌株增多等有關[5]。

針對北疆早熟棉區黃萎病發病日趨嚴重的情況，本研究有針對性地采集了典型發病地的病株進行分離和鑒定，并測定其生物學性狀，了解北疆早熟棉區黃萎病病菌的菌落類型及培養特性，為北疆棉花抗病育種、品種合理布局及病害防治提供理論依據。

1材料與方法

1.1菌株的分離純化

[JP2]2013—2014年于棉花黃萎病發病高峰期，在北疆第五師、第七師和第八師各選取5個典型重病地采集病株，[JP3]進行病原菌分離、純化與保存；對照菌株V991由南京農業大學提供。

1.2不同溫度對菌株生長和產孢的影響

將直徑為5 mm的菌塊接種于PDA平板上，分別置于15、20、25、30、33 ℃恒溫培養箱中培養，重復3次。用十字劃線法測量恒溫培養第5、第10天的菌落直徑；觀察記載 25 ℃ 條件下培養第15天的菌落形態，然后在每皿中加入 10 mL 無菌水，洗下的孢子液用血球計數板測定其濃度。

1.3不同pH值對菌株生長的影響

將直徑為5 mm的菌塊分別接種于pH值為4、5、6、7、8、9的PDA平板上，置于25 ℃恒溫培養箱中恒溫培養，10 d后測量其菌落直徑，重復3次。

1.4菌絲致死溫度的測定

將直徑為5 mm的菌塊置于加有1 mL無菌水的已滅菌1.5 mL EP管中，分別在溫度為45、50、55、60、65、70 ℃的水浴鍋中處理10 min，然后將菌塊取出置于PDA平板上，10 d后觀察其生長情況，重復3次。

1.5數據處理與分析

原始數據用Excel進行處理后，采用SPSS 17.0進行方差分析，通過Duncans法進行多重比較。

2結果與分析

2.1棉花黃萎病病菌的培養性狀觀察

在北疆早熟棉區（第五師、第七師、第八師）采集的病株上共分離到65個菌株，經鏡檢鑒定為大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb.），然后進行形態學鑒定，在每個師各篩選5個菌株作為供試菌株。

供試菌株在PDA平板上生長的菌落大多為圓形或橢圓形，少數為不規則形狀。15個供試菌株及對照菌株V991均屬于菌核型，可產生大量微菌核，其中9個菌株（包括V991）的微菌核呈從內向外放射狀，占所有菌株的 56.25%；其余7個菌株的微菌核呈同心輪紋狀，占43.75%；菌絲致密的菌株（包括V991）有13個，占所有菌株的81.25%；菌絲稀疏的有3個，占18.75%（表1）。

2.2不同溫度條件對菌株生長速度和產孢量的影響

供試菌株在不同溫度條件下，其生長速度存在差異性。

由表2可見，供試菌株在15～30 ℃條件下均可生長，但在 33 ℃ 條件下，V1、V2、V5、V15等4個菌株完全停止生長，其余菌株生長極緩慢。在不同溫度條件下供試菌株的產孢量之間差異明顯。由表3可見，15～30 ℃條件下各菌株均可產孢，但在33 ℃條件下菌株V2不產孢，其余菌株均可產孢，但產孢量極少，平均值為0.5×107個/mL。25 ℃條件下，第五師、第七師和第八師菌株的平均生長速度最快（圖1），但在20 ℃條件下平均產孢量最多（圖2）。33 ℃條件下菌株生長速度最慢，產孢量也最少。

2.3不同pH值條件下菌絲的生長情況

不同pH值條件下菌落生長情況差異明顯。表4表明：供試菌株在pH值為4～9范圍內均可生長，pH值在5～7范圍內生長速度較快，pH值為4時生長速度最慢。

第五師、第七師和第八師的菌株在pH值為6時生長速度最快，pH值為4時生長速度最慢。

2.4菌絲致死溫度的測定

由表5可知，供試菌株中只有V3的致死溫度為65 ℃，時間為10 min，僅占6.25%；其中有5個菌株及對照V991菌絲的致死溫度、時間為60 ℃、10 min，占37.50%；其余9個菌絲的致死溫度、時間為 55 ℃、10 min，占56.25%。第五師5個菌株中除V3外，V1、V2菌株的菌絲致死溫度、時間均為 60 ℃、10 min，其余2個菌株的菌絲致死溫度、時間均為 55 ℃、10 min；第七師5個菌株中V7的菌絲致死溫度、時間為60 ℃、10 min，其余4個菌株的菌絲致死溫度、時間均為 55 ℃、10 min；第八師5個菌株中V11、V13的菌絲致死溫度、時間為60 ℃、10 min，其余3個菌株的菌絲致死溫度、時間均為55 ℃、3討論

北疆早熟棉區黃萎病病菌的菌落以菌核型為主，這與以前同類研究結果[6]基本一致。Pullman等研究表明，30～33 ℃ 會抑制黃萎病病菌的生長和孢子的萌發[7]，本研究結果與之相似。本研究中33 ℃時有75%的菌株仍能緩慢生長，并產生少量孢子，這與張莉等的研究結果[8]不一致，表明北疆早熟棉區黃萎病病菌的耐高溫能力可能有所增強，這也可能是造成當前新疆棉花黃萎病在高溫期仍然發病較重的原因之一。30 ℃ 條件下發現有個別菌株由菌核型轉為菌絲型，這與朱荷琴等研究的高溫脅迫下溫度對病原菌的培養特性有影響[9]一致。pH值在4～9范圍內菌株均可生長，pH值在5～7范圍內菌株生長速度較快，表明pH值是影響棉花黃萎病病菌生長的因素之一。6.25%菌株致死溫度、時間為 65 ℃、10 min，3750%菌株致死溫度、時間為60 ℃、10 min，56.25%的菌株致死溫度、時間為 55 ℃、10 min， 表明北疆早熟棉區黃萎病病菌對高溫具有一定的耐受性，籍秀琴等認為高溫可明顯控制黃萎病的發生[10]，棉田遭遇連續高溫容易產生隱癥，但是一旦環境條件適宜即可暴發成災。

本研究僅從北疆早熟棉區中的第五師、第七師和第八師采集了15個重病田的病株，只能代表北疆早熟棉區局部黃萎病病菌的類型。下一階段的任務是廣泛采集病樣，進行PCR分子鑒定及致病力分化研究，以便為新疆棉花黃萎病的防控提供理論依據。

參考文獻：

[1]新華網. 新疆棉花產量首次超過全國一半[EB/OL]. （2012-12-28）[HJ1.9mm][2015-09-10]http：//news.Xinhuanet.corn/fortune/2012-12/28/e-114194610.htm.

[2]劉海洋，王偉，張仁福，等. 新疆棉花黃萎病發生調查及病原菌系統進化分析[J]. 新疆農業科學，2015，52（1）：65-71.

[3]繆衛國，田逢秀. 新疆棉花枯、黃萎病發生趨勢及研究現狀[J]. 新疆農業科學，2000（增刊1）：107-109.

[4]石磊巖，馮潔，王莉梅，等. 北方植棉區棉花黃萎病菌生理分化類型研究[J]. 棉花學報，1997，9（5）：273-280.

[5]李國英，張新全，宋玉萍，等. 北疆棉區棉花黃萎病發生趨勢、抗性研究[J]. 新疆農業科學，2015，52（1）：185-190.

[6]李國英，霍向東，田新莉，等. 新疆棉花黃萎病菌的培養特性及致病性分化的研究[J]. 石河子大學學報（自然科學版），2000，4（1）：9-15.

[7]Pullman G S，Devay J E.Epidemiology of Veticillium wilt of cotton： effects of disease development on plant phenology and line yield[J].Phytopathology，1982，72（5）：554-559.

[8]張莉，馬慧寧，陳文霞，等. 石河子地區棉花黃萎病菌致病型監測研究[J]. 安徽農業科學，2007，35（16）：4879-4880，4882.

[9]朱荷琴，宋曉軒，簡桂良. 溫度脅迫對棉花黃萎病菌致病力的影響[J]. 棉花學報，2003，15（1）：33-36.

[10]籍秀琴，馬存. 棉花黃萎病消長與溫度關系的分析[J]. 農業科技通訊，1980（8）：30-31.