甘蔗離體抗旱突變體的篩選及生理特性

蒙秋伊+羅凱+劉鵬飛+張正學

摘要：用0.2%甲基磺酸乙酯（EMS）處理黔糖5號甘蔗愈傷組織4 h，在100 g/L PEG脅迫下進行抗旱性突變體篩選，得到抗旱誘變植株。在盆栽條件下對抗旱突變體進行干旱脅迫，測定甘蔗幼苗葉片的質膜透性、葉綠素熒光參數等相關生理指標。結果表明，突變株系的最大光化學效率（Fv/Fm）增強，游離脯氨酸含量、葉綠素含量維持高水平，丙二醛（MDA）含量減少，細胞膜透性減小。對抗旱指標葉綠素熒光參數、相對電導率、MDA含量、脯氨酸含量、葉綠素含量等進行綜合評價，誘變植株B1、B2、B5各項抗旱指標靠前。說明經EMS誘變和PEG篩選得到的抗性植株在耐旱性方面比對照強，篩選的甘蔗突變體比對照具有更強的抗旱性。

關鍵詞：甘蔗；誘變；抗旱突變體；生理特性；愈傷組織；葉綠素熒光參數

中圖分類號： S566.103.4文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）04-0099-04

貴州蔗區多為旱坡地，缺乏灌溉條件，旱災頻發，嚴重制約產業發展和蔗農增收。培育節水抗旱、豐產優質的甘蔗新品種，是解決干旱問題經濟有效的手段之一。創造耐旱資源的方法很多，除自然變異外，還有太空誘變、射線誘變、化學誘變等[1]，其中化學誘變由于技術簡單，引起的變異豐富，受到育種界廣泛關注。Nilan等用硫酸二乙酯（DES）處理大麥種子，育成了產量高、莖稈矮、抗倒伏的品種Luther[2]。此后，農作物化學誘變育種在世界各國得以推廣，到1990年為止，利用化學誘變育成的新品種（系）有106個，約占誘變育成品種（系）的7%，以禾谷類居多，其中大麥l5個、水稻12個、小麥9個、玉米7個[3]。付鳳玲等用 60Co γ射線和疊氮化鈉（NaN3）處理玉米愈傷組織，經過1.0% NaCl高滲培養基篩選，得到1個耐旱性與耐旱自交系81565接近的株系，并從M1代株系中發現了1個細胞核隱性單基因控制的孢子體雄性不育的雄性不育株[4]。陳麗等通過甲基磺酸乙酯（EMS）處理楊樹胚性愈傷組織定向篩選耐鹽突變體，獲得耐鹽性明顯比對照高的突變體株系[5]。許莉萍等以磷酸鹽為選擇劑，從高產低糖的甘蔗品種中篩選出穩定的磷酸鹽抗性細胞系，其再生植株群體含糖量較對照高[6]。甘蔗體細胞無性系耐旱突變體的研究結果如下，Yadav等在不同NaCl濃度和聚乙二醇（PEG） 8000作用下，離體選擇經輻射誘變的CoC671體細胞無性系，得到耐鹽性和抗旱性增強的突變體[7]。這些研究表明經過物理化學誘變后，在一定的選擇壓力下可以從產生的變異體中篩選出抗旱性強的細胞系。本試驗利用甘蔗離體培養，結合EMS誘變和PEG定向篩選技術，以期獲得甘蔗育種的中間材料，為以后選育抗旱性強的甘蔗新品種提供育種材料。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料為黔糖5號甘蔗。化學誘變劑為美國SIGMA公司生產的甲基磺酸乙酯（EMS）。

1.2試驗方法

1.2.1材料處理

取甘蔗莖梢幼葉為外植體，用自來水洗凈，剝去幾層，留下長7～8 cm、直徑1.5～2.0 cm的嫩葉梢；用75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗3～5次；再用0.1% HgCl2消毒10 min，無菌水沖洗3～5次；在無菌濾紙上吸干表面的水，再切去兩端，剝去2～3層，留下長4～5 cm、直徑0.5～1.0 cm 的嫩葉梢，橫切成0.5～1.0 mm厚的圓形薄片，接入誘導培養基培養。

1.2.2培養條件及培養基

誘導培養基為MS+2.0 mg/L 2，4-D+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂粉；分化培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂粉；生根培養基為1/2MS+2.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L PP333+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂粉。誘導愈傷組織在25 ℃下暗培養，分化及生根培養溫度為25 ℃，光照時間12 h/d，光照度為1 500 lx。

1.2.3甘蔗愈傷組織的EMS誘變處理

用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH值7.0）配制濃度為0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的EMS溶液，過濾滅菌，以不含EMS的磷酸緩沖液處理為對照。取黔糖5號甘蔗愈傷組織用EMS溶液浸泡，每個濃度下分別浸泡2、4、6、8 h后，無菌水沖洗，再接種于誘導培養基恢復，一共24個處理，每個處理6皿。愈傷組織接種于誘導培養基暗培養3～5 d后轉入分化培養基誘導分化，25 d統計分化率，確定EMS 50%致死劑量。

[JZ]愈傷分化率=分化苗數/接種愈傷組織塊數×100%；

[JZ]愈傷相對分化率=處理分化率/對照分化率×100%。

1.2.4選擇劑PEG濃度的確定

采用PEG 6000模擬干旱脅迫，配制PEG濃度為0、20、40、60、80、100 g/L的1/2 MS培養基，以未經誘變處理的黔糖5號甘蔗分化苗為材料，每處理分別接種50株于上述培養基中，重復3次，培養30 d觀察生根情況，確定PEG處理臨界濃度。

[JZ]生根率=生根的外植體數/接種的外植體數×100%。

1.2.5抗旱突變體的篩選

將經EMS處理后的突變體植株進行PEG脅迫，接種到含100 g/L PEG的1/2MS生根培養基中，進行抗旱篩選，25 ℃條件下培養30 d，再觀察其生根情況。根據根系發育情況判斷其抗旱性強弱，其中根系生長勢強的為抗旱植株，完全不生根的為不抗旱植株。

1.2.6干旱脅迫處理

將黔糖5號甘蔗突變體株系移栽至盆缽，以同期分化出的未處理的組培再生苗為對照，定量供水保持土壤水分一致性，生長盛期時停止澆水，停止澆水前采樣測定一次抗旱性生理指標；10 d后土壤表面發白，甘蔗葉片部分卷曲，葉間部分枯萎，清晨無吐水現象，再次采樣進行抗旱性生理指標測定。

1.2.7抗旱突變體株系的生理生化鑒定

用FMS-1脈沖調制式熒光儀測定+1位葉最大光化學效率（Fv/Fm），采用電導率法[8]測定質膜透性，用硫代巴比妥酸法[9]測定丙二醛（MDA）含量，采用張憲政的方法[10]測定葉綠素含量，采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量。

1.2.8數據處理

所有數據均用Microsoft Office Excel 2007整理，數據的統計分析均采用SPSS 20.0軟件進行分析。抗旱性分析采用模糊數學中的隸屬函數法，對抗性植株進行各種生理指標的綜合評定，按照隸屬函數加權值的高低評判抗旱性強弱。

若生理指標與抗旱性成正相關，隸屬函數X=（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin）；若生理指標與抗旱性成負相關，隸屬函數X=1-（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin）。

式中：Xi代表生理指標測定值；Xmin代表不同品種甘蔗各株系所對應生理指標的最小值；Xmax代表不同品種甘蔗各株系所對應生理指標的最大值。

2結果與分析

2.1EMS處理對幼胚愈傷組織分化率的影響

表1表明，隨著EMS濃度的增加、誘變處理時間的加長，甘蔗愈傷組織分化率逐漸降低。誘變處理時間為8 h，EMS濃度為0.2%時，甘蔗愈傷組織相對分化率降為0，說明EMS處理時間對愈傷組織分化率影響很大。在EMS濃度為 0.2%～0.4%、處理時間為4 h，以及EMS濃度為0.4%、處理時間為2 h時，相對分化率為50%左右。

2.2選擇劑PEG濃度的確定

由圖1可見，未經EMS處理的黔糖5號分化苗在生根培養基中的生根率隨著PEG濃度升高而降低，當PEG濃度為20 g/L時，生根率在85%左右；PEG濃度為60 g/L時，生根率降到50%；PEG濃度達到80 g/L時，生根率僅為14.6%，[JP3]甘蔗分化苗的根生長受到明顯的抑制；當PEG濃度達到100 g/L時，[JP]

生根率降到10%以下，表明外植體幾乎不耐受100 g/L PEG的干旱脅迫。因此，可采用100 g/L作為篩選抗旱突變體的PEG濃度。

2.3抗旱突變體的篩選

將經過EMS處理后的愈傷組織分化的504株分化苗接種到含100 g/L PEG的1/2MS生根培養基中篩選抗旱突變體，共得到生根的抗旱植株5株。在未經EMS處理的、僅為磷酸緩沖液處理的再生植株中，未獲得抗旱植株。

2.4抗旱突變體株系的生理指標鑒定

將黔糖5號甘蔗5株抗性突變體植株移栽，命名為B1～B5，對其進行生理指標測定，以無處理的同期移栽再生苗為對照。

2.4.1干旱脅迫對抗性植株葉綠素熒光參數的影響

從圖2可以看出，在未經干旱處理時，各植株最大光化學效率（Fv/Fm）均在0.83左右，且無顯著差異。在干旱處理后，各植株的Fv/Fm均有下降，抗性植株下降幅度較小，下降幅度最大，其他株系仍維持高水平，顯著高于，這表明誘變甘蔗具有一定的抗旱適應性。

2.4.2干旱脅迫對抗性植株相對電導率的影響

由于在水分脅迫條件下植物細胞膜會受到損傷，電導率大小可衡量傷害程度[11]。如圖3所示，在沒有停水干旱處理時，各植株相對電導率維持在正常水平，相互間無顯著差異。干旱處理后，的相對電導率升至62.7%，抗性植株則顯著較低，其中B5最低，僅為32.1%。這表明干旱脅迫下抗性植株的質膜受傷害程度比輕，說明誘變甘蔗具有一定的抗旱性。

2.4.3干旱脅迫對抗性植株MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一，它的產生會加劇膜的損傷，因此在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA含量是一個常用指標，可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統受損程度以及植物的抗逆性[11]。如圖4所示，各參試株系的MDA含量在未停水干旱處理時均處于同一水平；干旱處理后MDA含量均大幅升高，尤其是、B3和B5，這3株漲幅最大，而B1、B2和B4則漲幅最小，顯著小于其他株。表明干旱脅迫引起甘蔗葉片的膜脂過氧化作用，多數抗性植株能有效降低膜脂過氧化和膜系統的傷害程度，比對照更能適應干旱環境，具有一定耐旱性。

2.4.4干旱脅迫對抗性植株游離脯氨酸含量的影響

在干旱脅迫條件下，許多植物體內脯氨酸大量積累。植物體內脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強的品種往往積累較多的脯氨酸[12]。如圖5所示，各參試植株經過干旱脅迫處理后，游離脯氨酸的含量升高，B1、B2、B3、B5顯著高于，B4與差異不顯著。所有參試株系在未干旱處理前脯氨酸含量幾乎在同一水平，無顯著差異，說表明誘變甘蔗抗旱性有所提高。

2.4.5干旱脅迫對抗性植株葉綠素含量的影響

葉綠素含量的變化對光合作用產生直接影響，水分脅迫下葉綠素含量的變化可以指示植物對水分脅迫的敏感性，并直接影響光合產量。在控水未開始時，參試株的葉綠素含量無顯著差異。干旱處理后，葉綠素含量下降，其中B1、B5的葉綠素含量顯著高于（圖6）。

2.4.6抗性植株抗旱性綜合評價結果

為了全面反映甘蔗EMS誘變株經PEG脅迫后的抗旱性，采用模糊數學中的隸屬函數法，對抗旱指標葉綠素熒光參數、相對電導率、MDA含量、脯氨酸含量、葉綠素含量等進行綜合評價。隸屬函數值即其加權值，加權值越大，表示耐旱性越好。如表2所示，B1、B2、B5抗旱性排在前3位，可見經EMS誘變和PEG篩選得到的植株有較強的耐旱性。

3結論與討論

EMS因其誘變效率高、誘變范圍廣而在誘變育種中得到廣泛使用，EMS不同濃度及不同處理時間對胚性愈傷組織的后效作用很明顯。黔糖5號在0.2%～0.4% EMS下處理 2～4 h，胚性愈傷組織褐死率為50%左右，達半致死劑量。小麥花藥愈傷組織用EMS溶液處理的較佳組合為0.2% EMS處理2～6 h，幼胚愈傷組織為（0.2%～0.4%）EMS處理24 h[13]。EMS處理獼猴桃胚性愈傷組織較佳組合為0.6% EMS處理2 h[14]。隨著EMS濃度的升高和處理時間的延長，胚性愈傷組織褐死率呈上升趨勢，增殖倍數和分化率呈下降趨勢，這與前人的研究結果[15]相似。

試驗利用半致死劑量EMS處理甘蔗愈傷組織，并在PEG脅迫壓力下篩選出甘蔗抗旱突變體5株，并進行生理指標鑒定，以無處理的同期移栽再生苗為對照。抗性植株干旱處理下仍具有較高的光系統Ⅱ活性，脯氨酸、葉綠素含量維持高水平，相對電導率、MDA含量低于，表明誘變甘蔗在干旱環境下，受傷害程度比較小，耐旱性得到提高。

常規育種是最主要的育種手段，雖然選育到的變異多能穩定遺傳，但育種周期長、進程慢，難以獲得突變性變異。化學誘變突變率相對較高，能誘發出各種有用的突變基因，能夠在原有遺傳背景基本不變的情況下在分子水平上使植物出現有用性狀的變異。但誘發突變的方向和性質尚難掌握，突變后有利個體往往不多。本試驗得到了一些抗旱性增強的甘蔗株系，僅在實驗室條件下得到驗證，是否屬于基因水平上的變異、能否在大田栽培中有穩定的表現，仍需進一步研究。

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