IL1R1基因多態(tài)性與黑衣壯兒童哮喘的相關性研究

蔡旭龍 林瑪麗 曹珊 林娜

【摘要】目的研究白介素1受體Ⅰ型（Interleukin 1 receptor，type Ⅰ，IL1R1）基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點rs1558641和rs949963與哮喘易感的相關性。

方法采用病例對照的研究方法，收集廣西百色地區(qū)屬于壯族分支的黑衣壯人群，哮喘兒童80例，健康兒童100例，通過聚合酶鏈反應連接酶檢測反應（polymerase chain reactionligase detection reaction，PCRLDR）對IL1R1的rs1558641和rs949963位點多態(tài)性進行基因分型。

結果IL1R1基因rs1558641位點檢測出CC、CT、TT基因型，rs949963位點檢測出AA、AG、GG基因型，兩個位點基因型、等位基因在哮喘和健康組中分布均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；通過SHEsis軟件計算連鎖不平衡（LD）的系數(shù)，結果D=1，r2=1。

結論IL1R1基因SNP位點rs1558641和rs949963有完全連鎖現(xiàn)象，rs1558641和rs949963位點多態(tài)性可能是黑衣壯兒童哮喘的易感因素。

【關鍵詞】IL1R1；多態(tài)性；哮喘；黑衣壯

中圖分類號：R725.6文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2017.01.002

A study on association of IL1R1 gene polymorphism with asthma in blackclothing Zhuang children

[HJ1*2][HJ]

CAI Xulong1，LIN Mali1，CAO Shan1，LIN Na2▲

（1.Graduate School，2.Department Pediatrics of Affiliated Hospital，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China）

[HJ2][HJ]

【Abstract】ObjectiveTo study relationship between single nucleotide polymorphism（SNP） site rs1558641 and rs949963 of interleukin 1 receptor，type （IL1R1） and susceptible asthma.

MethodsCasecontrol study was adopted in this research.80 children with asthma and 100 healthy controls in blackclothing Zhuang people in Baise area of Guangxi were collected.And then，polymorphism genotyping was performed through polymerase chain reactionligase detection reaction （PCRLDR），so as to carry out polymorphism genotyping of rs1558641 and rs949963 loci in IL1R1.

ResultsCC，CT and TT genotypes were detected in IL1R1 gene rs1558641 locus，and AA，AG and GG genotypes were detected in rs949963 locus.Distributions of genotypes and alleles of the two locus（rs1558641 and rs949963） in asthma group and healthy group all had statistically significant difference（P<0.05）.The coefficient of linkage disequilibrium （LD） was calculated by SHEsis software，and the results was：D=1，r2=1.

ConclusionThere is a complete linkage between SNP rs1558641 and rs949963 locus in IL1R1，so polymorphisms rs1558641 and rs949963 locus may be susceptible factors of asthma children in blackclothing Zhuang population.

【Key words】IL1R1；polymorphism；asthma；blackclothing Zhuang population

哮喘疾病是世界性難題，患者在不斷增加，目前全球范圍約有3億患者。哮喘使患者及其家庭經(jīng)濟負擔加重，生活質(zhì)量也受較大影響。哮喘是由嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、中性粒細胞、黏液細胞等多種細胞參與的以慢性氣道炎癥為特征的一種異質(zhì)性的疾病，表現(xiàn)為喘鳴、氣短、胸悶、咳嗽和呼氣氣流受限。哮喘發(fā)病機制復雜，目前尚不十分清楚，與環(huán)境因素和遺傳因素關系密切。白介素1受體Ⅰ型（IL1R1）在大多數(shù)細胞上表達，作為白介素1（IL1）的受體，在IL1信號通路中起重要作用。有研究表明IL1R1可以放大IL1作用，與炎癥反應、哮喘和過敏性疾病關系密切[1]。本次研究IL1R1基因rs1558641和rs949963位點的多態(tài)性與黑衣壯兒童哮喘的相關性。

1對象與方法

1.1研究對象

2015年6月至2016年5月期間在右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院門診和病房收集80例哮喘兒童，男48例，女32例，年齡2.3～8.3歲，平均（4.3±1.3）歲，哮喘診斷符合2008年兒童支氣管哮喘診斷標準[2]。100例健康兒童作為對照，為同期體檢的健康兒童，男65例，女35例，年齡3.8～5.7歲，平均（4.5±0.7）歲，無過敏史，家族中無哮喘及其他免疫性疾病患者。兩組研究對象三代均為黑衣壯，相互之間無血緣關系。在年齡及性別組成上兩組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。根據(jù)知情同意原則，與患兒家長簽訂知情同意書，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2主要試劑和儀器

東勝龍黑金剛EDC810 PCR儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）；3730XL基因測序儀（ABI公司）；Allegra 25R高速離心機（貝克曼公司）；Micro 17R微量臺式離心機（賽默公司）；微量可調(diào)移液器（Eppendorf公司）；Taq酶（Fermentas公司）；dNTP（Fermentas公司）；Taq DNA ligase（NEB公司）；人血液DNA提取試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）。

1.3標本采集

空腹抽1 ml靜脈血，存放在EDTA抗凝管中，用于DNA的提取，收集的標本保存在-80℃冰箱待檢。

1.4IL1基因多態(tài)性分析

用人全血DNA提取試劑盒提取DNA（上海捷瑞生物工程有限公司），提取的DNA由上海捷瑞生物工程有限公司用聚合酶鏈反應連接酶檢測反應（PCRLDR）對基因位點進行基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）分型。擴增rs1558641位點和rs949963位點的引物及探針序列見表1。PCR擴增：總反應體積為15 μL，10×Buffer 1.5 μL，MgCl2 1.5 μL，DNTP 0.3 μL，引物0.15 μL/條，Taq酶0.3 μL，模板DNA 1 μL，雙蒸水補至15 μL。充分混勻，放入PCR擴增儀擴增。PCR反應體系于94℃預變性3 min后，按程序94℃ 30 s→55℃ 30 s→72℃ 90 s 擴增35個循環(huán)，最后 72℃延伸3 min。連接反應：總反應體積為10 μL PCR產(chǎn)物3 μL，10×Taq DNA ligase buffer 1 μL，Taq DNA ligase（40 U/μL）0125 μL，探針（10 pmol/μL）0.01 μL/條，H2O補至 10 μL。連接條件：94℃ 30 s→56℃ 3 min 擴增30個循環(huán)。取1 μL反應產(chǎn)物，加8 μL上樣loading buffer，95℃變性3 min，立即冰水浴，上測序儀測序。

1.5統(tǒng)計學方法

采用 SPSS 17.0 軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，兩組的基因型和等位基因用計數(shù)法計算頻率，HardyWeinberg遺傳平衡定律檢驗群體代表性，兩組的基因型頻率和等位基因頻率采用χ2檢驗作比較，檢驗水準：α=0.05。

2結果

2.1SNP各種基因表型結果

通過LDR反應產(chǎn)物的測序長度對各基因型進行判斷，純合子只有1種片段長度，雜合子包含2種純合子的片段長度。rs1558641位點根據(jù)所設計的探針，C基因型的片段長度為57 bp，T基因型的片段長度為60 bp。rs949963位點根據(jù)所設計的探針，A基因型的片段長度為78 bp，G基因型的片段長度為81 bp。經(jīng)3730XL基因測序儀（ABI公司）基因檢測，GeneMarker V1.5分析，SNP分型結果顯示rs1558641和rs949963位點均分別有CC、CT、TT和AA、AG、GG 3種基因型（圖1、2）。

2.2IL1R1多態(tài)性位點基因型及等位基因分布頻率

哮喘組及健康對照組均符合HardyWeinberg遺傳平衡定律（P>0.05），有群體代表性。rs1558641和rs949963位點基因型頻率及等位基因頻率在健康對照組和哮喘組之間分布均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2、表3。

2.3rs1558641和rs949963位點連鎖不平衡情況

連鎖不平衡（LD）又稱等位基因關聯(lián)，是指同一條染色體上，兩個等位基因間的非隨機相關，即兩個等位基因（A，B）位于同一條染色體的同時存在的概率（PAB）大于人群中因隨機分布而同時出現(xiàn)的概率時，就稱這兩個位點處于LD狀態(tài)。通過SHEsis軟件計算連鎖不平衡的系數(shù)D和r2來衡量LD強度，結果D=1，r2=1，說明rs1558641和rs949963位點完全連鎖。

注：箭頭所指A圖單峰表示CC基因型；B圖雙峰為CT基因型；C圖呈現(xiàn)單峰為TT基因型。

圖1IL1R1基因SNP rs1558641位點基因表型結果

注：箭頭所指A圖單峰表示AA基因型；B圖雙峰為AG基因型；C圖呈現(xiàn)單峰為GG基因型。

圖2IL1R1基因SNP rs949963位點基因表型結果

表2IL1R1基因rs1558641位點基因型頻率和等位基因頻率比較[n（%）]

組別n

基因型頻率CCCTTTχ2P

等位基因頻率CTχ2P

健康對照組10063（63.0）34（34.0）3（3.0）6.1280.047160（80.0）40（20.0）5.3920.020

哮喘組8040（50.0）31（38.7）9（11.3）111（69.4）49（30.6）

表3IL1R1基因rs949963位點基因型頻率和等位基因頻率比較[n（%）]

組別n

基因型頻率GGAGAAχ2P

等位基因頻率GAχ2P

健康對照組10063（63.0）34（34.0）3（3.0）6.1280.047160（80.0）40（20.0）5.3920.020

哮喘組8040（50.0）31（38.7）9（11.3）111（69.4）49（30.6）

3討論

哮喘在各個年齡段均可以發(fā)病，但多數(shù)發(fā)生在兒童期。哮喘對兒童的學習、生活影響巨大。哮喘是由環(huán)境和遺傳共同作用的復雜疾病，特點是氣道平滑肌收縮，黏液分泌過度、水腫和氣道高反應性[4]。環(huán)境因素觸發(fā)或調(diào)節(jié)哮喘發(fā)生，而哮喘遺傳因素易感性尚沒有完全了解。單核苷酸多態(tài)性分析已被廣泛應用于復雜遺傳性疾病的研究。全基因組關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)目前哮喘相關的候選基因超過300個，其中IL1R1基因與哮喘有關[6～7]。也有研究發(fā)現(xiàn)IL1R1與癌癥、睡眠的調(diào)節(jié)有關[8～9]。

IL1R1位于染色體2q12區(qū)域，該區(qū)域內(nèi)的許多基因均與哮喘相關[10]，與IL1R2、IL1RL2和IL1RL1形成細胞因子受體基因簇。IL1R1是白細胞介素1受體家族的一員，是一種糖蛋白，分子量約為80 kDa，主要表達于內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、上皮細胞、肝細胞、成纖維細胞、表皮細胞、表皮樹突狀細胞和T淋巴細胞[11]。Schmitz等[12]用哮喘的小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)IL1R1在輕型和重型哮喘發(fā)病機制中有重要作用。

在本次研究中rs1558641和rs949963位點基因型頻率成對出現(xiàn)，經(jīng)計算分析這兩個位點完全連鎖，千人基因組數(shù)據(jù)庫中中國漢族也完全連鎖。rs1558641位點基因型和等位基因頻率在健康組和哮喘組之間分布均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），rs949963位點的數(shù)據(jù)結果與rs1558641位點相同。rs1558641位點中TT基因型可能是哮喘的易感基因型，T等位基因可能是患哮喘的風險因子。在rs949963位點的研究中AA基因型可能是哮喘的易感基因型，A等位基因可能是患哮喘的風險因子。Chen J等研究中國漢族人群rs1558641位點多態(tài)性與FEV1%和總血清IgE相關，該位點多態(tài)性與哮喘臨床特征相關[13]。

本次研究rs1558641和rs949963位點多態(tài)性在黑衣壯人群中完全連鎖，與千人計劃組數(shù)據(jù)庫中北京地區(qū)漢族人群的研究結果一致。IL1R1基因的rs1558641和rs949963位點多態(tài)性可能是壯族兒童哮喘的風險因素。本次研究的樣本量少，結果可能有偏頗。今后需進一步廣泛深入研究，與其他民族或人種綜合比較分析，進一步了解哮喘發(fā)病機制。

參考文獻

[1]Madore AM，Vaillancourt VT，Bouzigon E，et al.Genes Involved in Interleukin1 Receptor Type II Activities Are Associated With Asthmatic Phenotypes[J].Allergy Asthma Immunol Res，2016，8（5）：466470.

[2]中華醫(yī)學會兒科學會呼吸學組，《中華兒科雜志》編輯委員會.兒童支氣管哮喘診斷與防治指南[J].中華兒科雜志，2008，46（10）：745753.

[3]Farahani R，Sherkat R，Hakemi MG， et al.Cytokines （interleukin9，IL17，IL22，IL25 and IL33） and asthma[J].Adv Biomed Res，2014，3：127.

[4]Lee S，Park J，Park C.The Search for Genetic Variants and Epigenetics Related to Asthma[J].Allergy Asthma Immunol Res，2011，3（4）：236244.

[5]Bφnnelykke K，Sleiman P，Nielsen K，et al.A genomewide association study identifies CDHR3 as a susceptibility locus for early childhood asthma with severe exacerbations[J].Nature Genetics，2013，46（1）：5155.

[6]Ingiosi AM，Opp MR.Sleep and immunomodulatory responses to systemic lipopolysaccharide in mice selectively expressing interleukin1 receptor 1 on neurons or astrocytes[J].Glia，2016，64（5）：780791.

[7]De Marco P，Lappano R，F(xiàn)rancesco EMD，et al. GPER signalling in both cancerassociated fibroblasts and breast cancer cells mediates a feedforward IL1β/IL1R1 response[J].Scientific Reports，2016，6：24354.

[8]Martinez FD，Vercelli D.Asthma[J].Lancet，2013，382（9901）：13601372.

[9]Vasilyev FF，Silkov AN，Sennikov SV.Relationship between interleukin1 type 1 and 2 receptor gene polymorphisms and the expression level of membranebound receptors[J].Cell Mol Immunol，2015，12（2）：222230.

[10]Schmitz N，Kurrer M，Kopf M.The IL1 receptor 1 is critical for Th2 cell type airway immune responses in a mild but not in a more severe asthma model[J].Eur J Immunol，2003，33（4）：9911000.

[11]Chen J，Zhang J，Hu H，et al.Polymorphisms of RAD50，IL33 and IL1RL1 are associated with atopic asthma in Chinese population[J].Tissue Antigens，2015，86（6）：443447.

（收稿日期：2016-11-24修回日期：2016-12-26）

（編輯：潘明志）