利用穴盤育苗篩選抗根腫病大白菜材料的實用技術

徐立功+韓太利+孫繼峰+楊曉東+譚金霞

導讀：大白菜根腫病在全國乃至世界范圍內(nèi)的發(fā)生日趨嚴重，嚴重影響著大白菜的品質(zhì)和產(chǎn)量。通過不斷試驗，探討出一套利用穴盤育苗篩選大白菜抗根腫病材料的實用技術，以期為大白菜根腫病抗性品種的快速、有效選育提供依據(jù)。

目前國內(nèi)對十字花科根腫病的研究集中在其致病機理及病害防控上，對選育抗病品種這一最為經(jīng)濟有效的防病方法的技術研究卻不多。利用基質(zhì)和穴盤育苗篩選抗根腫病材料對關鍵環(huán)節(jié)的技術要求較高，通過2013-2015年3年的試驗積累，探討出一套利用穴盤育苗篩選大白菜抗根腫病材料的實用技術，再結(jié)合田間抗性鑒定、單株留種，希望為大白菜根腫病抗性品種的快速、有效選育做出貢獻。

1 新鮮根腫組織中休眠孢子的分離提純

接種用休眠孢子最好從新鮮根腫組織中提取，可保證孢子的致病力。為避免其他雜菌、雜物對試驗結(jié)果的影響，需對休眠孢子進行分離、提純。根腫組織流水沖洗干凈后晾干，-20℃冰箱中冷凍備用。將10 g根腫組織切碎，加50 mL 滅菌水，在研缽中研細或用榨汁機打碎，然后用4層脫脂紗布過濾，將濾液移入一干凈的50 mL離心管，3 100 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀重溶于50 mL滅菌水，

3 100 r/min離心10 min，此步操作重復2次。棄上清液，在沉淀中加5 mL 50%蔗糖溶液，混勻后，3 100 r/min離心10 min，用移液槍把上清液小心移入1支干凈的離心管，加30 mL滅菌水，3 100 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀重溶于30 mL滅菌水，3 100 r/min離心10 min，此步操作重復2次，最后沉淀溶于5 mL滅菌水，-20℃冰箱中冷凍備用。

2 育苗接種專用試驗棚的準備

有條件的地區(qū)，可利用單獨的日光溫室或于發(fā)病地頭建塑料大拱棚，專做抗根腫病材料苗期接種、篩選試驗用，同時注意防止休眠孢子的擴散。或做長×寬×高為150 cm×30 cm×120 cm的可移動鋁合金棚架，兩寬面置外拉門，四面均用60目防蟲網(wǎng)罩起。棚架上部設單脊雙面屋頂，用塑料膜覆蓋防雨。竹條苗床裁成合適大小置于棚底。將網(wǎng)棚置于易于隔離、通風見光良好的地塊，內(nèi)掛2塊黃板，處于網(wǎng)棚中上部位置。網(wǎng)棚周圍鋪0.5 m石灰條帶防止孢子擴散。當外界溫度高于25℃時，棚頂要覆遮光率50%的遮陽網(wǎng)遮光。

3 帶菌基質(zhì)配制及材料播種

3.1 帶菌基質(zhì)配制

大白菜一般用50穴穴盤育苗，舊穴盤要用50%百菌清可濕性粉劑1 000倍液噴灑消毒、沖洗晾干后方可使用。秋季育苗基質(zhì)配方為草炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1，春季育苗基質(zhì)配方為草炭∶蛭石∶珍珠巖=6∶1∶3。裝盤時，將菌液稀釋后均勻拌入基質(zhì)，按根腫組織∶基質(zhì)=1∶20的質(zhì)量比摻勻。

3.2 播種

華北地區(qū)一般春季在2月底3月初，秋季在8月下旬，將試驗材料播種于穴盤中，每穴1～2粒，要保證種子的純度和凈度在99%以上。蛭石和珍珠巖（體積比1∶1）覆蓋后，將苗盤移到育苗接種專用試驗棚苗床上，澆透水，春季覆膜保墑秋季不用。保證棚內(nèi)夜溫16～23℃、晝溫20～26℃，溫度過低時加蓋保溫材料，過高時通風及覆遮陽網(wǎng)遮蔭。

4 播種后管理及傷根處理

4.1 播種后苗盤管理

播種后5天左右大白菜即可出苗，要及時揭膜，防止烤苗。子葉展平前及時間苗、移補苗。出苗后視基質(zhì)含水量，一般每2～3天微噴1次清水，澆水量不宜過大，防止稀釋基質(zhì)中孢子濃度，保持基質(zhì)濕度60%～70%即可。幼苗第3片真葉展開時，結(jié)合澆水，每3～5天噴施1次瑞萊20-10-20通用型肥料1 000倍液。氣溫高時，澆水次數(shù)增加至每天1次，但注意控制噴水量，保持基質(zhì)濕度70%～80%即可。如網(wǎng)棚中不慎進入害蟲，可用1.8%阿維菌素乳油2 000～3 000倍液防治菜青蟲、夜蛾等，用10%吡蟲啉可濕性粉劑3 000倍液防治蚜蟲。

4.2 傷根處理

為提高接種的成功率，出苗后15～20天，在早晨或傍晚進行1次傷根處理。操作時，距白菜幼苗根莖部0.5～1.0 cm，用小刀垂直于穴孔基質(zhì)表面插下至穴孔底部，注意不要傷及幼苗主根、割破穴盤，一刀即可。傷根后及時澆水。

5 統(tǒng)計調(diào)查

一般出苗后45天左右，感病對照品種全部發(fā)病時開始統(tǒng)計調(diào)查。由于穴盤育苗的大白菜根系緊緊纏繞基質(zhì)，不易將根系完全洗出，為保持抗病材料根系的完整性以便定植，采用直接觀察根坨法統(tǒng)計：0級，主根、側(cè)根無腫塊；1級，側(cè)根有明顯腫塊，主根無腫塊；2級，主根有明顯腫塊，側(cè)根無腫塊；3級，主、側(cè)根均有少量明顯腫塊；4級，主、側(cè)根均有大量嚴重腫塊。材料抗病性評估標準：高抗，0<病情指數(shù)<10；抗病，10≤病情指數(shù)<20；耐病，20≤病情指數(shù)<30；感病，30≤病情指數(shù)≤100。病情指數(shù)=

[∑（各級發(fā)病株數(shù)×各病級代表數(shù)值）/（調(diào)查總數(shù)×最高病級代表數(shù)值）]×100。調(diào)查后的根腫組織可洗凈晾干后，凍于-20℃冰箱中留待下次接種用。

6 抗病單株的田間鑒定、留種

對于初選出的高抗或抗病單株材料，春季若通過春化處理（種子催芽后，0～3℃冰箱中20天低溫處理再播種穴盤），可直接定植于根腫病選種專用試驗田進行小株采種，同時進行田間抗病性鑒定、篩選；秋季則先定植于根腫病選種專用試驗田，11月下旬經(jīng)田間抗病性鑒定后，選取母株入窖假植，來年春天再定植進行成株采種。

7 穴盤育苗接種法與其他抗性檢測方法的比較分析

2013年9月，針對16份大白菜自交系材料對根腫病4號優(yōu)勢生理小種的抗性（接種用病樣采自青島農(nóng)業(yè)科學院試驗田），田間種植抗病性鑒定和穴盤育苗接種抗性檢測的同時，委托青島農(nóng)業(yè)大學園藝學院對材料進行抗病主效基因CRa和CRb的PCR檢測，結(jié)果表明，穴盤育苗接種法與田間抗病性鑒定的結(jié)果最相近，比抗病基因PCR檢測法的準確率高出11.8%（表1）。

與菌土法、蘸根法、浸芽法、注射法等人工接種鑒定方法相比較，穴盤育苗接種直接用草炭配制的基質(zhì)試驗，pH值6.0左右，滿足根腫病發(fā)病條件，操作簡便；篩選出的抗病單株材料由于是穴盤育苗，定植于根腫病選種試驗田后緩苗快，成活率高；穴盤育苗微環(huán)境的一致性和后繼的田間抗病性鑒定，提高了抗病材料篩選的準確率；穴盤育苗便于集約化操作，可同時篩選大量材料，加快了抗病品種選育進程。