MMP-9基因-1562C/T變異與吸煙的交互作用對頸動脈易損斑塊的影響

蔣健剛 蘭景良 王曉華 杜曉馬

MMP-9基因-1562C/T變異與吸煙的交互作用對頸動脈易損斑塊的影響

蔣健剛 蘭景良 王曉華 杜曉馬

目的 探討MMP-9基因-1562C/T位點變異與頸動脈易損斑塊的關系，及基因多態性和吸煙在頸動脈易損斑塊易感性中的交互作用。方法 358例符合納入標準的患者根據頸動脈超聲分為易損斑塊組（122例）和穩定斑塊組（236例）。采用PCR-RFLP方法檢測兩組-1562C/T位點基因型，比較兩組基因型及等位基因頻率分布差異，應用相加模型分析-1562C/T變異與吸煙對易損斑塊的交互作用。 結果 易損斑塊組攜帶T等位基因頻率（20.90%）明顯高于穩定斑塊組（11.65%）（χ2=10.91，P＜0.01），易損斑塊組的吸煙率也明顯高于穩定斑塊組（χ2=9.74，P＜0.01）。T等位基因和吸煙對易損斑塊交互作用的定性分析顯示，相對于不吸煙且攜帶CC基因型個體，吸煙OR=1.56（P＜0.05），T等位基因OR=1.67（P＜0.05），同時吸煙又攜帶T等位基因OR=3.60（P＜0.01），吸煙與T等位基因存在正相加模型交互作用。多元logistic回歸分析顯示：控制年齡、性別、BMI、血壓、HbA1C和LDL-C等因素后，MMP-9基因-1562C/T變異T等位基因與吸煙的協同作用指數為2.12，歸因交互效應為1.36，歸因效應為37.78%，純因子間交互作用為52.30%。 結論 MMP-9基因-1562C/T變異與吸煙對頸動脈易損斑塊的影響存在協同交互作用；對于攜帶T等位基因并吸煙的個體，盡早戒煙可能可以降低發生頸動脈易損斑塊的風險。

頸動脈易損斑塊 基因多態性 基質金屬蛋白酶-9 吸煙 交互作用

近年來，隨著老齡化社會的到來及人們生產生活方式的改變，心腦血管疾病發病率和致殘、致死率都有了明顯的上升。動脈發生粥樣硬化是心腦血管疾病發生的病理學基礎，頸動脈因其具有位置表淺、走向平直、易于檢測等優點，而通常被作為反應全身動脈硬化程度的一個窗口，頸動脈易損斑塊可能與嚴重心腦血管事件密切相關[1]。研究表明：血漿基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9）水平在動脈粥樣斑塊的發生、發展中發揮重要作用，而其編碼基因也被認為與許多心腦血管疾病有重要關聯[2]。眾所周知，吸煙也是動脈發生粥樣硬化的重要危險因素，但目前尚未見有關MMP-9基因變異和吸煙對頸動脈易損斑塊交互作用的相關報道。本文將這一問題作初步的研究，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2014年5月至2016年5月在我院體檢和就診的頸動脈斑塊患者358例。根據頸動脈彩超結果[3]，將斑塊為無回聲和低回聲的122例納入易損斑塊組，男73例，女49例，年齡43～77（63.74±9.36）歲。提示為強回聲的236例為穩定斑塊組，男134例，女102例，年齡41～76（63.28±10.14）歲。兩組對象性別、年齡差異均無統計學意義（均P＞0.05）。所有研究對象均為中國浙江金華地區漢族常住人口，彼此間無任何血緣關系。排除標準：除外近1年內發生過腦卒中、顱內感染、心肌梗死、心房纖維性顫動、心瓣膜病、動脈瘤、嚴重肝腎功能不全、各種血液病、風濕免疫性疾病、各種傳染病、慢性炎癥性疾病、腫瘤、妊娠及非自愿參加者。本研究通過醫院倫理委員會審批，全部研究對象均為自愿參加并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 頸動脈彩超檢查 頸動脈彩超檢測由2位高年資超聲診斷科醫師獨立操作完成，取兩者檢測結果一致的患者入組。分別檢測每例患者的雙側頸總動脈（common carotid artery，CCA）和CCA分叉處，而頸內動脈顱外段則用縱軸實時二維圖像進行測量。舒張末期時測量3處（CCA分叉處近端1cm、CCA分叉處及頸內動脈起始段1cm）后壁的內膜厚度（intima-media thickness，IMT），每側各測量3次，取3次的平均值。參照Mathiesen等[3]的方法及標準來確定彩超檢查方法及分類標準。以頸動脈穩定斑塊為病情穩定的參考標準，在本研究中作陰性對照（穩定斑塊組）；以易損斑塊作為病情進展的診斷標準，在本研究中視為觀察對象（易損斑塊組）。

1.2.2 吸煙的標準[4]近1年來，每天至少吸1支煙或每周吸煙超過7支。

1.2.3 采集標本 所有研究對象均在第2天抽取清晨空腹肘靜脈血5ml，其中3ml用于臨床生化指標測定，另外2ml置于EDTA抗凝管中，用于提取基因組DNA。

1.2.4 MMP-9基因-1562C/T位點變異檢測 （1）基因組DNA提取：用酚-氯仿經典方法提取外周血基因組DNA，并置于-20℃保存備用。（2）PCR擴增：引物設計參考文獻[5]：P1:5′-GCC TGG CAC ATA GTA GGC CC-3′；P2：5′-CTT CCT AGC CAG CCG GCA TC-3′。PCR反應體系為50μl：10×buffer 5μl、上下游引物各1μl、dNTPs（10mmol/L）2μl、基因組DNA 2μl、Taq plus DNA聚合酶2μl和ddH2O 37μl。PCR反應條件為95℃4min；95℃30s、55℃45s、72℃45s，進行35個循環；72℃7min。結束后取2μl反應產物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進行EB電泳檢測確認。（3）PCR產物酶切：酶切反應體系為：PCR產物 5.0μl：PaeⅠ內切酶 1U、10×酶切緩沖液1.0μl、ddH2O補足總體積至10.0μl；37℃水浴16h。（4）基因型辨別：取3.0μl酶切產物上樣，用2.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳（100V，30min），電泳后在紫外凝膠成像儀下拍照，根據酶切產物片段的組合型來判斷基因型。

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件。研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度，基因型和等位基因的組間比較采用χ2檢驗。計量資料以表示，符合正態分布在兩組間比較采用t檢驗。MMP-9基因-1562C/T變異與吸煙交互作用分析選用相加模型，OR計算及混雜因素的控制采用logistic回歸分析。

2 結果

2.1 MMP-9基因-1562C/T變異和吸煙與易損斑塊的關系

2.1.1 MMP-9基因-1562C/T位點基因型檢測結果 （1）PCR擴增結果：擴增目標片段為435bp（見圖1）。（2）PCR酶切結果：根據酶切后片段組合分為3種。野生型純合子（基因型C/C）不能被酶切，表現為一條長度為435bp的單條帶；突變型純合子（基因型T/T）完全被酶切，表現為長度為247bp和188bp的雙條帶；突變型雜合子（基因型C/T）部分被酶切，表現為長度為435、247和188bp的三條帶（見圖2）。

2.1.2 吸煙與易損斑塊的關系 易損斑塊組吸煙率為43.44%（53/122），高于穩定斑塊組的27.12%（64/236），兩組對象吸煙率比較差異有統計學意義（χ2=9.74，P＜0.01）。

2.1.3 MMP-9-1562C/T變異與易損斑塊的關系 易損斑塊組和穩定斑塊組MMP-9-1562C/T基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=1.52、0.92，P=0.22、0.34）。兩組對象的基因型及等位基因分布頻率差異見表1。

圖1 MMP-9基因-1562C/T位點PCR擴增電泳圖（泳道1、2、3、4、5、6為擴增產物，泳道N為空白對照，M為Marker）

圖2 MMP-9基因-1562C/T位點PCR擴增后酶切電泳圖（泳道1為空白對照，泳道2和3為C/C型，泳道4為T/T型，泳道5、6、7為C/T型，M為Marker）

表1 兩組對象基因型及等位基因分布頻率差異[例（%）]

由表1可見，兩組對象基因型分布差異有統計學意義（P＜0.01），易損斑塊組T等位基因分布頻率明顯高于斑塊穩定組（P＜0.01）。

2.2 MMP-9基因-1562C/T變異T等位基因和吸煙對易損斑塊的交互作用

2.2.1 T等位基因和吸煙對易損斑塊交互作用的定性分析 以是否是易損斑塊為因變量（易損斑塊=1，穩定斑塊=0），以是否攜帶T等位基因和吸煙為自變量，進行非條件logistic回歸分析，具體見表2。

表2 T等位基因與吸煙對易損斑塊交互作用的定性分析

由表2可見，相對于不吸煙且攜帶CC基因型個體，吸煙OR=1.56（P＜0.05），T等位基因OR=1.67（P＜0.05），同時吸煙又攜帶T等位基因OR=3.60（P＜0.01），后者的OR值大于前兩者OR值減去1后的相加值，吸煙與T等位基因存在正相加模型交互作用。控制性別、年齡、BMI、血壓、HbA1C、LDL-C等混雜因素后，吸煙OR=1.12（P＜0.05），T等位基因OR=2.61（P＜0.05），兩者聯合作用的OR=2.61（P＜0.01），吸煙與T等位基因仍具有正交互作用。

2.2.2 T等位基因和吸煙對易損斑塊交互作用的定量分析 控制混雜因素前，吸煙與T等位基因交互作用的協同效應指數為2.12，歸因效應為1.36，歸因交互效應為37.78%，純因子間歸因交互效應為52.30%，控制混雜因素后，以上指數分別為3.04、1.08、41.36%和67.01%。

3 討論

多年來人們通常將頸動脈管腔狹窄的嚴重程度作為評判動脈粥樣硬化進展程度的標準，且根據這一標準來判斷是否需要進行臨床干預。然而，有研究證實這個認識是狹隘的，該研究發現發生缺血性事件的主要影響因素是動脈粥樣斑塊的穩定性而不是管腔狹窄的嚴重程度，即對患有頸動脈粥樣硬化患者影響最大的因素是斑塊的質而不是量，導致缺血性事件發生的直接元兇是斑塊的易損性[6]。Naghavi等[7]指出易損斑塊的主要特點就是斑塊纖維帽薄、核心內有大量的脂質壞死物。

動脈粥樣硬化斑塊是引起冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的病理學基礎，MMP是內源性鋅依賴性酶家族的一員，是基質降解的重要調節因子，在維持血管穩定性和完整性方面發揮重要作用，與動脈粥樣硬化程度密切相關[1-2]。MMP-9基因-1562C/T是MMP-9基因轉錄啟動子上游1 562位點處的一個重要調控元件，該位點發生C→T變異后，將明顯影響血漿MMP-9表達[8]。研究發現[8]：該基因位點發生C→T變異的個體發生冠心病的風險較未發生變異者明顯升高，T等位基因可能明顯增加心肌梗死的發病風險。在本研究中單因素研究結果顯示，易損斑塊組的T等位基因頻率為20.90%，明顯高于穩定斑塊組的11.65%，差異有統計學意義（P＜0.01），提示 T等位基因可能與頸動脈斑塊易損性嚴重相關（OR=1.67），這與董翔等[9]的研究結果相類似。

研究表明，吸煙是引起動脈粥樣硬化斑塊不穩定的獨立危險因素[10]。王振東等[11]研究發現，吸煙可能是急性心肌梗死最主要的危險因素之一。在本研究中單因素研究結果顯示，易損斑塊組的吸煙率明顯高于穩定斑塊組，提示吸煙可能與頸動脈斑塊的不穩定性密切相關，吸煙可能是頸動脈斑塊發生易損的重要危險因素之一（OR=1.56）。

本研究對MMP-9基因-1562C/T變異與吸煙的交互作用分析結果顯示，兩者協同效應指數在控制混雜因素前后分別為2.12和3.04，純因子歸因交互效應百分比分別為52.30%和67.01%，說明無論是否控制混雜因素，兩者均存在協同交互作用，在僅僅由這兩個因素所致的斑塊發生易損的危險性中，扣除本底效應后由交互作用所產生的危險性占52%～67%，說明兩者間交互作用強。因此認為在攜帶-1562C/T變異T等位基因的個體中，戒煙可降低頸動脈斑塊發生易損的危險性，從而降低冠心病等心腦血管疾病的發病風險。但本研究受地域限制、納入樣本少、對斑塊穩定性的評判標準不是非常客觀及需要排除的混雜因素多等因素影響，結果可能會和實際情況有些差別，需要更進一步的深入研究。

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Interaction of MMP-9 gene-1562C/T mutation with smoking on susceptibility of instable carotid plaques

JIANG Jiangang,LAN Jingliang,WANG Xiaohua,et al.Department of Cardiovascular,Jinhua TCM Hospital,Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Jinhua 321017,China

Objective To investigate the relationship between polymorphism of MMP-9 gene-1562C/T and susceptibility of instable carotid plaques. Methods Total 358 patients with ultrasonic diagnosed-carotid plaques were enrolled in the study, including 122 cases with instable carotid plaques(instable group)and 236 cases with stable carotid plaques(stable group).The MMP-9 genotypes were detected by PCR-RFLP.Chi-square test was used to compare the distribution of the genotype and allele frequency between two groups.And the interaction of-1562C/T mutation with smoking on susceptibility of instability of carotid plaques was analyzed using additive model. Results The frequency of CT and TT genotypes in carotid instable group was significantly higher than that in the stable group(20.90%vs.11.65%,χ2=10.91,P＜0.01),and the frequency of smoking was also higher(χ2=9.74,P＜0.01).The qualitative analysis of interaction showed that compared to non-smokers carrying CC genotype,the OR value of smoker was 1.56(P＜0.05),the OR value of carrying T allele was 1.67(P＜0.05)and that of smokers carrying T allele was 3.60(P＜0.01),there was an additive interaction between smoking and T allele.Multiple logistic regression showed that after adjusting the gender,age,BMI,blood press,HbA1c and LDL-C,there was a positive interaction between T allele and smoking on instability of carotid plaques.The synergy index of 2.12,the attributable interaction index of.36;the attributable interaction percentage was 37.78%,and pure attributable interaction percentage was 52.30%. Conclusion There is a synergy between the-1562C/T mutation of MMP-9 gene and smoking on instability of carotid plaques.The study indicates that for smokers carrying the T allele to quit smoking may decrease the risk of instability of carotid plaques.

Carotid vulnerable plaque Gene polymorphisms Matrix metalloproteinase-9 Smoking Interaction

2016-11-23）

（本文編輯：沈昱平）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.7.2016-1763

321000 金華，浙江中醫藥大學附屬金華市中醫院心內科