非小細(xì)胞肺癌患者DC-CIK過繼免疫治療前后外周血TLR4表達(dá)的變化

王細(xì)勇 袁琳娜 張志豪

非小細(xì)胞肺癌患者DC-CIK過繼免疫治療前后外周血TLR4表達(dá)的變化

王細(xì)勇 袁琳娜 張志豪

目的 觀察細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（DC-CIK）過繼免疫治療前后非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者外周血單個核細(xì)胞（PBMC）Toll樣受體4（TLR4）mRNA表達(dá)變化,及脂多糖刺激下PBMC分泌細(xì)胞因子的變化,探討TLR4在DC-CIK過繼免疫治療中的作用。方法 對50例采用DC-CIK治療的NSCLC患者，運(yùn)用RT-PCR檢測治療前后PBMC TLR4mRNA表達(dá)變化，ELISA法檢測治療前后NSCLC患者PBMC在脂多糖刺激下細(xì)胞因子（IL-6、IL-8及TNF-α）分泌的變化。 結(jié)果 DC-CIK治療后NSCLC患者PBMC TLR4mRNA的表達(dá)水平較治療前顯著降低（t=6.272，P＜0.01）；脂多糖刺激下PBMC分泌IL-6（t=17.407，P＜0.01）、IL-8（t=15.244，P＜0.01）及TNF-α（t=12.428，P＜0.01）顯著減少。 結(jié)論 DC-CIK過繼免疫治療可能通過降低PBMC TLR4mRNA的表達(dá)，提高機(jī)體抗腫瘤免疫功能。

樹突狀細(xì)胞 細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞 非小細(xì)胞肺癌 TLR4

肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]。非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占肺癌總數(shù)的85%，5年生存率僅為15%。目前對于NSCLC的治療除了手術(shù)、放療、化療等傳統(tǒng)手段外，又出現(xiàn)了靶向治療、免疫治療等新興療法。其中，DC-CIK細(xì)胞療法是過繼細(xì)胞免疫治療的首選方案[2]。研究表明，DC-CIK細(xì)胞治療能顯著提高NSCLC患者的生存期[3]。Toll樣受體4（TLR4）是連接固有免疫及適應(yīng)性免疫的重要橋梁，表達(dá)于多種免疫細(xì)胞[4]。本研究將通過比較NSCLC患者DC-CIK治療前后外周血單個核細(xì)胞（PBMC）TLR4mRNA表達(dá)及功能變化，探討TLR4在過繼細(xì)胞免疫治療中的作用機(jī)制及地位，為NSCLC的DC-CIK的治療提供理論依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 2012年6月至2014年6月，武警浙江總隊(duì)嘉興醫(yī)院胸心外科就診并經(jīng)病理檢查確診的NSCLC患者50例，均行DC-CIK治療。50例NSCLC患者中，男31例，女19例，年齡38～78（62.24±8.62）歲。肺腺癌22例，鱗狀細(xì)胞癌28例。高分化癌11例，中低分化癌39例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者19例。吸煙36例，不吸煙14例；TNM分期根據(jù)2009年國際抗癌聯(lián)盟（UICC）分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，其中Ⅰ期12例，Ⅱ期27例，Ⅲ期11例，無Ⅳ期患者。患者均接受過肺癌的規(guī)范化治療（包括手術(shù)治療及放、化療等）；血常規(guī)正常，心、肝、腎功能可耐受生物治療；Karnofsky功能狀態(tài)評分（KPS評分）＞60分；末次治療至開始接受DC-CIK細(xì)胞免疫治療的間隔時間≥4周；手術(shù)患者切口完全愈合；無感染、其他惡性腫瘤及傳染性疾病；對生物制品無過敏。

1.2 主要試劑 淋巴細(xì)胞分離液購自北京賽馳生物科技有限公司；腫瘤細(xì)胞株購自金斯瑞生物科技有限公司；重組人IFN-γ、IL-2、GM-CSF、IL-4、TNF-α均購自上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司；抗人CD3單抗購自北京思科達(dá)生物科技有限公司；胎牛血清為美國Hyclone公司產(chǎn)品，RPMI-1640培養(yǎng)基為美國Gibco產(chǎn)品。總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及DNA ladder均購自TAKARA公司；TaqDNA聚合酶，dNTP均購自天為時代公司；TLR4（622 bp）引物：5′-CTGCAATGGATCAAGGACCA-3，5′-TCCCACTCCAGGTAAGTGTT-3′；βactin（374 bp）引物：5′-CGTGACATTAAGGAGAAGCTGTGC-3′，5′-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT-3′；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。人IL-6、IL-8及TNF-α雙抗夾心Elisa檢測試劑盒購自上海巧伊生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗原制備方法 根據(jù)患者腫瘤類型選擇相同病理的腫瘤細(xì)胞株制備抗原。取對數(shù)生長期的細(xì)胞株細(xì)胞，加入0.9%氯化鈉溶液調(diào)細(xì)胞數(shù)至5×106/ml，反復(fù)凍融（-196～37℃）12次。細(xì)胞裂解物經(jīng)12 000r/min離心5min，取上清液備用。

1.3.2 DC-CIK細(xì)胞制備誘導(dǎo)方法 無菌抽取患者外周血50ml，常規(guī)Ficoll密度梯度離心法分離PBMC，加入適量RPMI-1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/ml，加入培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育2h。吸出未貼壁細(xì)胞，經(jīng)離心洗滌后以PRMI-1640培養(yǎng)液重懸（密度2×106/ml），接種于培養(yǎng)瓶，加入重組人IFN-γ 100μg/L及重組人IL-2 500kU/L，第2天加入抗人CD3單抗50μg/L,保持細(xì)胞密度（1～2）×106/ml，于第10～11天收集多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK細(xì)胞）。在剩下的貼壁細(xì)胞中加入含重組人GM-CSF（100μg/ L）、重組人IL-4（50μg/L）的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3d換液1次，于培養(yǎng)的第5天加入腫瘤裂解物（40μg/ml），于第6天加入重組人TNF-α（500U/ml），培養(yǎng)至第7天即獲得抗原致敏的樹突狀細(xì)胞（DC細(xì)胞）。將DC及CIK細(xì)胞以1∶20比例混合，用含重組人IL-2（250kU/L）的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)4d，即為DC-CIK細(xì)胞。

1.3.3 DC-CIK治療方案 將經(jīng)鑒定和質(zhì)檢合格（細(xì)菌、真菌培養(yǎng)陰性，細(xì)胞活性＞95%）的DC-CIK細(xì)胞制成含1%白蛋白及0.9%氯化鈉溶液的細(xì)胞混懸液，分4次經(jīng)靜脈回輸，每療程回輸細(xì)胞總數(shù)為（5～10）×109個。

1.3.4 RT-PCR檢測PBMC TLR4mRNA表達(dá) 于DCCIK治療前1d及治療后第10天，無菌條件下分別取患者外周血5ml，常規(guī)Ficoll密度梯度離心法分離PBMC。按照總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，進(jìn)行紫外定量，并鑒定RNA的質(zhì)量。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。25μlPCR體系，β-actin為內(nèi)參。擴(kuò)增參數(shù)：94℃5min；再以94℃40s、50℃40s、72℃90s為1循環(huán)，共30個循環(huán)；72℃5min。PCR產(chǎn)物在含有g(shù)oldview的1.5%瓊脂糖凝膠上95V恒壓電泳35min，最后置于凝膠成像分析儀觀察結(jié)果，TLR4 mRNA和β-actin均能擴(kuò)增成功。

1.3.5 ELISA檢測脂多糖誘導(dǎo)外周血PBMC釋放細(xì)胞因子 于DC-CIK治療前1d及治療后第10天，無菌條件下分別取患者外周血5ml，常規(guī)Ficoll密度梯度離心法分離PBMC。加入適量含脂多糖（1μg/ml）的RPMI-1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/ml，加入培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中孵培養(yǎng)24h。取上述細(xì)胞懸液，4℃，3 000r/min離心3min，收集上清液。根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測上清液中IL-6,IL-8,TNF-α水平。

1.3.6 計(jì)算機(jī)圖像處理 RT-PCR用bandscan4.3，對每個目的條帶進(jìn)行總光密度值的分析，以目的產(chǎn)物條帶與β-actin產(chǎn)物條帶的OD值的比值代表目的基因mRNA表達(dá)的相對水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，治療前后比較采用配對t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1DC-CIK治療前后NSCLC患者PBMC TLR4mRNA表達(dá) 見圖1。

由圖1可見，DC-CIK治療后NSCLC患者外周血PBMC TLR4mRNA的表達(dá)量（0.43±0.15）低于治療前的表達(dá)量（0.60±0.12），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.272，P＜0.01）。

2.2 DC-CIK治療前后NSCLC患者IL-6、IL-8、TNF-α水平的比較 見表1。

由表1可見，DC-CIK治療后NSCLC患者PBMC在脂多糖刺激下IL-6、IL-8及TNF-α分泌顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 DC-CIK治療前后NSCLC患者PBMC TLR4mRNA表達(dá)

表1 DC-CIK治療前后NSCLC患者IL-6、IL-8、TNF-α水平的比較

3 討論

大量研究表明，惡性腫瘤患者免疫系統(tǒng)（尤其是細(xì)胞免疫系統(tǒng)）表現(xiàn)出明顯功能障礙，主要包括CD3+CD4+T細(xì)胞減少，CD3+CD8+T細(xì)胞增多，CD4+/CD8+比例降低，以及NK細(xì)胞活性降低[5]，腫瘤患者外周血中有功能的成熟DC細(xì)胞數(shù)量顯著減少，未成熟DC細(xì)胞數(shù)量聚集[6]。過繼細(xì)胞免疫治療能提高患者免疫力，達(dá)到治療和預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的目的。

CIK細(xì)胞是人外周血PBMC加入各種細(xì)胞因子共刺激后得到的一群異質(zhì)細(xì)胞，主要效應(yīng)細(xì)胞既表達(dá)T細(xì)胞標(biāo)記CD3，又表達(dá)NK細(xì)胞標(biāo)記CD56，對腫瘤細(xì)胞具有非主要組織相容性復(fù)合體（MHC）限制的強(qiáng)大細(xì)胞毒反應(yīng)[7]，在腫瘤的過繼免疫治療中顯示出了重大的應(yīng)用價值。DC是人體功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，由DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)形成的DC-CIK細(xì)胞，具有比CIK細(xì)胞更強(qiáng)的增殖活性及細(xì)胞毒性，并在臨床應(yīng)用中具有更少的不良反應(yīng)[8]。DC-CIK細(xì)胞療法在臨床上已用于甲狀腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌，肝癌等惡性腫瘤，并取得了一定的治療效果[9]。

Toll樣受體（TLRS）屬于模式識別受體家族，可以識別多種病原微生物產(chǎn)物及內(nèi)源性配體[10-11]，其中，TLR4是TLRs家族成員中研究較深入的受體之一。TLR4廣泛表達(dá)于多種免疫細(xì)胞，它介導(dǎo)MyD88依賴性及非依賴性信號途徑，從而促進(jìn)免疫細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-8及TNF-α等炎性細(xì)胞因子[12]。鑒于TLR4在免疫系統(tǒng)中的重要作用，

TLR4與腫瘤免疫的關(guān)系已有很多研究，研究表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的TLR4受體激活可能導(dǎo)致腫瘤免疫抑制[13]，死亡腫瘤細(xì)胞釋放的高遷移率族蛋白1（HMGB1）和DC細(xì)胞表達(dá)的TLR4的相互作用是腫瘤細(xì)胞免疫抗原交叉遞呈所必需的，也可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞毒T細(xì)胞特有的反應(yīng)[14]。但DC-CIK治療后，NSCLC患者外周血PBMC其表達(dá)及功能變化國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，DC-CIK治療后NSCLC患者PBMC TLR4mRNA的表達(dá)較治療前顯著降低，在TLR4天然配體脂多糖刺激下，PBMC分泌炎性因子（IL-6、IL-8及TNF-α）顯著減少。血清中IL-6細(xì)胞因子水平升高與進(jìn)展期腫瘤患者免疫抑制有關(guān)[15]，IL-8是炎癥致癌的主要因子之一，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[16]，而TNF-α雖然能直接或介導(dǎo)免疫反應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞，但如果TNF-α異常增高，會造成腫瘤患者免疫紊亂，使腫瘤細(xì)胞逃避宿主免疫監(jiān)視[17]。這也提示DC-CIK過繼免疫治療可以抑制PBMC的TLR4信號，使TLR4介導(dǎo)的炎癥因子產(chǎn)生減少，進(jìn)而減少慢性炎癥及免疫抑制，從而抑制腫瘤的生長和進(jìn)展。

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Changes of TLR4 mRNA expression in peripheral blood of patients with non-small cell lung cancer after DC-CIK immunotherapy

WANG Xiyong，YUAN Linna，ZHANG Zhihao.Department of Cardiothoracic Surgery，Jiaxing Armed Police Corps Hospital，Jiaxing 314000，China

Objective To investigate the changes of TLR4 mRNA expression in peripheral blood mononuclear cell (PBMC)of patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)after DC-CIK immunotherapy.Methods The mRNA expression of TLR4 in PBMC was detected by reverse transcription PCR(PT-PCR)in 50 patients with NSCLC before and after DC-CIK therapy.The secretion of cytokines(IL-6,IL-8 and TNF-α)of PBMC stimulated with LPS was detected by ELISA before and after DC-CIK therapy. Results After DC-CIK treatment,the relative expression level of TLR4 mRNA in PBMC of NSCLC patients was significantly decreased(t=6.272,P＜0.01),the secretion of IL-6(t=17.407,P＜0.01),IL-8(t=15.244,P＜0.01)and TNF-α (t=12.428,P＜0.01)by PBMC stimulated with LPS was significantly decreased. Conclusion DC-CIK immunotherapy can down-regulate TLR4 expression in PBMC of NSCL patients to enhance the anti-tumor immunity.

Dendritic cells(DC) Cytokine-induced killer(CIK) Non-small cell lung cancer TLR4

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10.3969/j.issn.1000-1905.2013.01.016.

2015-11-24）

（本文編輯：楊麗）

doi：10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.7.2015-1401

314000 武警浙江總隊(duì)嘉興醫(yī)院胸心外科

王細(xì)勇，E-mail：wxyong@163.com