蠶豆醬傳統釀造過程中細菌菌群的動態變化

蒯 輝， 朱林江， 劉春鳳， 李 崎*

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品安全與營養協同創新中心，江蘇 無錫 214122）

蠶豆醬傳統釀造過程中細菌菌群的動態變化

蒯 輝1，2， 朱林江1，2， 劉春鳳1，2， 李 崎*1，2

（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品安全與營養協同創新中心，江蘇 無錫 214122）

蠶豆醬傳統釀造過程中微生物的動態變化對其產品的成熟、風味形成及食品安全具有重要影響。為了有效分析蠶豆醬的傳統日光暴曬釀造過程中菌種的動態變化，作者采用菌株專一性的Rep-PCR指紋技術，分析可培養細菌菌種在釀造過程中的定量變化，并分離鑒定優勢菌株。結果表明，日光暴曬的傳統釀造過程中，好氧細菌總數均在較高水平，為107～108CFU/g，主要為芽孢桿菌屬，包括枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），淀粉液化芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）和甲基營養型芽孢桿菌（B.methylotrophicus）。兼性厭氧菌的數量在103～104CFU/g，主要是是蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）。發酵前期枯草芽孢桿菌為優勢菌，占80%以上，到發酵后期，淀粉液化芽孢桿菌和甲基營養型芽孢桿菌含量增多。所以，該蠶豆醬傳統釀造過程中，芽孢桿菌起到主要的作用；此外，蠟狀芽孢桿菌含量較多，這與敞開式發酵相關，但與好氧菌相比，其數量保持較低水平，表明其生長受到一定抑制，從而能夠保證這一傳統發酵食品的安全性。

豆瓣醬；傳統發酵；細菌；動態變化；Rep-PCR指紋圖譜鑒定技術

傳統發酵豆瓣醬是豆瓣、面粉等植物性原料，經過米曲霉接種和天然曬露發酵，再經調配加工而成，其營養豐富、易于消化、風味獨特、口感細膩。具有生理功能，如抑制血清膽固醇上升、抑制肝脂肪積蓄、預防肝癌、降血壓、去除放射性物質、防止胃潰瘍、抗氧化作用等[1-2]。豆瓣醬的傳統發酵過程中，有大量的微生物參與代謝，加上光照、溫度變化等產生一系列非酶化學反應，這些復雜的生物和非生物反應，給豆瓣醬產品帶來獨特的風味特色[3-4]。此外，豆瓣醬制作工藝和風味特征具有典型的地域特征。豆瓣醬傳統發酵歷史雖悠久，但仍保持傳統手工作坊方式，生產水平低、發酵周期長（約3個月）、規模化程度低、發酵條件不易控制、產品安全得不到保障等問題[5]；同時其傳統發酵方式的風味形成機制仍需大量的研究，包括微生物菌群的變化和特征微生物的分離鑒定。

目前國內外對傳統發酵豆瓣醬微生物的研究有很多，例如劉福林等[6]研究多種菌種協同作用發酵豆瓣醬，提高原料蛋白質和淀粉的利用率，增強醬的風味。貢漢坤等[7]使用稀釋涂布平板的方法從傳統發酵的醬中分離了占優勢的霉菌、酵母菌和乳酸菌等，其中乳酸菌包括片球菌 （Pediococcus spp.）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。高秀芝等[8]采用變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）的方法對山東傳統發酵豆醬進行研究，發現成品醬中的優勢細菌主要包括乳酸乳球菌 （Lactococcus lactis）和地衣芽孢桿菌的近緣種（B.licheniformis）等。Nam[9]等人采用高通量測序的方法研究韓國豆瓣醬doenjang細菌組成，發現韓國中部地區的豆瓣醬中主要的細菌為芽孢桿菌，而韓國其它地區的豆瓣醬中主要的細菌為乳酸菌。Kim等人使用PCR-DGGE的方法研究了日本豆瓣醬中的微生物，發現其中的優勢菌為嗜鹽四聯球菌（Tetragenococcus halophilus）、雞葡萄球菌 （Staphylococcus gallinarum） 和魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）[10]。然而，對豆瓣醬的傳統釀造過程中微生物菌種的定量變化研究較少。

針對豆瓣醬中微生物菌落分析方法主要包括基于培養基的細菌、酵母、霉菌總數分析和基于樣品總DNA的PCR-DGGE方法或基于16SrDNA的高通量測序方法[9，11]。基于總DNA的分析方法，能夠較全面的分析微生物組成，但難以定量分析，同時微生物的發酵活性難以確定。而基于培養基的分析方法，可實現定量分析，但難以鑒定平板分離的各個菌落，即菌種組成。為快速鑒定各個菌落，可采用菌株專一性的Rep-PCR指紋技術，快速區分各個菌落，從而定量分析菌種的組成，鑒定優勢菌株[12-13]。Rep-PCR指紋技術是基于原核及真核生物體基因組中廣泛分布著一類短重復序列，因短重復序列在屬、種和菌株水平上有分布和拷貝數量的差異性，且具有高度保守性，從而用于對菌株進行分型和同源性分析，能夠快速鑒定到菌株水平[14]。為了定量分析豆瓣醬傳統釀造過程中菌種變化，作者針對安徽地區一著名蠶豆醬產品釀造過程，采用菌株專一性Rep-PCR技術，選取原核微生物通用引物M13進行指紋擴增[15]，分析其釀造過程中各個菌種的定量變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 蠶豆醬樣品：傳統發酵30、40、50、60、70、80 d樣品，安徽安慶某釀造食品有限公司；溶菌酶：上海生工生物有限公司；PCR相關試劑、核酸電泳相關試劑、T載體相關試劑：TaKaRa公司；16S rDNA引物對：27F（上游）5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’；1541R （下 游 ）5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。M13-PCR引物：5’-GAGGGTGGCGGTTCT-3’。

1.1.2 儀器 核酸電泳儀：北京市六一儀器廠；紫外照膠系統：美國UVP凝膠成像系統；PCR儀：美國Thermo公司；QYC 2102恒溫搖床：上海福瑪實驗設備有限公司；GSP-9050MBE隔水式恒溫培養箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；HH-4型數顯恒溫水浴鍋：金壇市富華電器有限公司；密封罐和吸氧袋：淮安九和生物科技有限公司。

1.1.3 培養基 好氧細菌的分離培養用LB培養基，厭氧細菌的分離培養用MRS培養基。LB培養基：蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，氯化鈉 10 g，瓊脂18 g，加水定容至1 000 mL，自然pH值，121℃下滅菌20 min；MRS培養基：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸氫二銨2 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，吐溫-80 0.1 g，瓊脂18 g，加水定容至1 000 mL，自然pH值，115℃下滅菌15 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 醬醅樣品細菌的平板培養分離 取1 g傳統發酵醬醅樣品于小三角瓶（內置玻璃珠若干）內，加9 mL無菌水，打散混勻。取4個試管，編號1、2、3、4，各加9 mL無菌水，取1 mL樣品稀釋液于1號試管內，混勻；從1號試管中取1 mL于2號試管內，混勻，依次稀釋至10-5稀釋度。各取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的樣品稀釋液100 μL，分別均勻涂布于LB和MRS培養基平板上，每個稀釋度涂兩個平板。涂布好后，將LB平板于37℃倒置培養12 h，MRS平板放入密封罐中，迅速放入吸氧袋并蓋緊蓋子，于32℃倒置培養2～3 d。培養好后，取出平板，選擇合適的稀釋梯度進行菌落計數，并將平板上的若干單菌落分別接種至相應的新鮮培養基中，好氧細菌接種到透氣管中，于搖床中37℃、200 r/min培養12 h，厭氧細菌接種到厭氧管中，于32℃靜置培養24～36 h。培養好后各取500 μL菌液加上500 μL 30%的甘油，混勻后-20℃保藏。

1.2.2 醬醅樣品中細菌DNA的提取 分離培養的好氧細菌和厭氧細菌培養液用于提取DNA，采用之前報道的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[16]，其步驟簡單介紹如下：收集細胞后用含有800 μL CTAB的 DNA提取緩沖液懸浮細胞，加入 100 μL、50 mg/mL的溶菌酶，37℃水浴至少30 min；加入80 μL 10%SDS和10 μL、20 mg/mL的蛋白酶K，混勻，55℃水浴1 h，期間每隔15 min上下顛倒混勻；取出后12 000 r/min離心5 min，小心吸取中間層于新的2 mL離心管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）和氯仿/異戊醇（24∶1）依次混勻，12 000 r/min離心，取上清液；加入等體積異丙醇，顛倒混勻，-20℃沉淀1 h；12 000 r/min離心10 min，棄上清液；加入1 mL 70%乙醇，12 000 r/min離心5 min，棄盡上清液，室溫干燥10～15 min后用50 μL 1×TE Buffer溶解所提得DNA，供下一步實驗或-20℃冷凍保藏。

1.2.3 細菌的 Rep-PCR指紋鑒定及 16S rDNA PCR測序鑒定 將所提基因組作為模板，進行M13-PCR指紋擴增，反應體系25 μL，組分如下：ddH2O 13.9 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，M13引物（濃度10 μmol/L）4 μL，rTaq DNA聚合酶 0.6 μL，DNA模板 2 μL。反應程序如下：94℃變性3 min后，42℃退火2 min，72℃延伸3 min，94℃變性45 s開始循環，42℃退火40 s，72℃延伸2 min，35個循環后，72℃延伸10 min，4℃恒溫。PCR產物用1 g/dL核酸膠電泳，凝膠成像儀拍照得到菌株M13指紋圖譜，將指紋圖譜進行分類，隨機選取每類指紋中的3株菌株的基因組作為16S rDNA PCR模板，進行PCR。反應體系25 μL，組分如下：ddH2O 17 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，27F引物和1541R引物（濃度10 μmol/L）各2 μL，rTaq DNA聚合酶0.5 μL，DNA模板1 μL。反應程序如下：94℃變性3 min后，從94℃變性40 s開始循環，56℃退火35 s，72℃延伸80 s，30個循環后，72℃延伸10 min，4℃恒溫。該PCR產物用1 g/dL核酸膠電泳，經凝膠成像儀拍照驗證正確后，寄送上海華大基因進行測序，測序結果在NCBI網站上BLAST進行比對，得到鑒定結果。

2 結果與討論

2.1 好氧細菌和厭氧細菌總數分析

為了分析蠶豆醬樣品中好氧菌總數，將傳統釀造過程中不同發酵時間 （30、40、50、60、70、80 d）的醬醅樣品，稀釋涂布平板，在37℃培養12 h，計數結果見圖1（a）。結果顯示，不同發酵天數的各樣品中好氧細菌總數均較高，維持在107～108CFU/g水平。在發酵前期即30 d，細菌總數已達到較高水平；而發酵過程中，細菌總數有一定的波動，這可能與取樣時間的天氣環境和工人翻搗醬醅的因素相關。

優化比較多種培養基，包括MRS培養基、M17培養基、MC培養基和TJA培養基，最終確定采用MRS培養基分析厭氧菌總數。將醬醅樣品稀釋涂布平板，在32℃經過2～3 d厭氧培養，選取合適稀釋度的平板進行菌落計數，結果見圖1（b）。結果顯示，不同發酵醬醅中的厭氧菌總數保持相對穩定，在103～104CFU/g水平，約為好氧菌的0.01%水平。

圖1 不同發酵天數醬醅好氧細菌和厭氧細菌總數及各菌比例分布Fig.1 Totalnumber of aerobic bacteria and anaerobic bacteria of paste samples from different fermentation stages and their bacteriaproportion

2.2 Rep-PCR指紋快速鑒定不同的菌落

為了有效分析蠶豆醬中細菌菌群的組成，需要對平板分離的菌落進行快速鑒定。首先形態觀察表明菌落主要呈兩種形態。一種菌落呈現較透明、扁平、光滑、邊緣整齊的菌落形態，另一種菌落呈現乳白色、不透明、凸起、邊緣不整齊，且經長時間培養后表面會形成明顯褶皺的菌落形態。再次，為了快速區分這些菌落，采用菌株專一性的M13-PCR指紋技術。針對每一個樣品，從平板上生長的菌落中，隨機選取40個菌落進行純培養和DNA提取；將每一個菌落的基因組進行M13-PCR；通過凝聚電泳得到菌落的M13-PCR指紋圖譜。本次研究針對6個樣品，每個樣品分析40個好氧菌菌落和40個厭氧菌菌落。如圖2為70 d樣品中部分菌落的PCR指紋，根據這些指紋特征，可區分相似形態的菌落之間在基因型上的差異。

由于M13-PCR指紋的多樣性并不復雜，根據其大小和亮度分布判斷指紋之間的差異，確定特征指紋。如圖2（a）中，17個好氧菌菌落，產生了6個特征指紋，即編號1～6。圖2（b）為17個厭氧菌菌落的指紋，包含了5種指紋，即編號為7～10。所以，通過特征指紋的聚類分析，將菌落進行分類，從而減少菌落鑒定的數量。

圖2 發酵70 d醬醅好氧細菌和厭氧細菌M13-PCR指紋圖譜Fig.2 M3-PCR fingerprints of aerobic bacteria and anaerobic bacteria of 70 d paste sample

2.3 16S rDNA測序鑒定細菌組成

為了鑒定菌株組成，針對每種特征指紋隨機挑選3株菌進行16S rDNA測序分析，經NCBI網站上BLAST比對后，鑒定菌種。測序比對結果的相似性均在99%以上。比對結果表明，同屬于一種特征指紋的菌株，均被鑒定為同一種菌；而不同特征指紋的菌株，則可能屬于同一種菌。所有鑒定的好氧菌主 要 由 3種 菌 組 成 ， 即 Bacillus subtilis、B. amyloliquefaciens和B.methylotrophicus；而厭氧菌主要是兼性厭氧的B.cereus和B.drentensis。如表1所示，其中B.subtilis包括了5種指紋，B.amyloliquefaciens包含了4種指紋，B.methylotrophicus包含了2種指紋以及B.cereus的5種指紋。指紋對應的菌株的性能差異，目前在做進一步的分析。

表1 好氧細菌和厭氧細菌M13-PCR特征指紋圖譜數量Table 1 M13-PCR fingerprint numbers of aerobic bacteria and anaerobic bacteria

根據以上菌株鑒定結果，分析細菌菌群在蠶豆醬發酵過程中的變化。在發酵的前期和中期，B.subtilis在好氧菌中占有較大比例，都超過了75%；B.amyloliquefaciens和B.methylotrophicus的比例相當，占總菌數的比例約在10%～20%。隨著發酵的進行，到發酵后期，B.amyloliquefaciens和B.methylotrophicus的數量開始增多，到發酵成熟時兩者占總菌數的比例都均超過了25%。在30 d的樣品中，好氧菌菌群中檢測了少量的B.cereus。而厭氧菌在蠶豆醬傳統發酵過程中變化不大，主要由兼性厭氧的B.cereus組成，只有在50 d的樣品中檢測到另外一種兼性厭氧菌B.drentensis。

根據以上研究結果，蠶豆醬傳統釀造過程中，占優勢的可培養細菌菌群并不豐富，主要由芽孢桿菌組成；發酵過程中，細菌菌群的變化主要表現為3種好氧芽孢桿菌比例的變化，其中B.amyloliquefaciens和B.methylotrophicus的比例在發酵后期略有增加，表明部分菌株具備一定的后期生長優勢。B.cereus的存在在蠶豆醬這種敞開式發酵過程中是難以避免的，會對食品安全性構成一定的威脅。不過，B.cereus雖被鑒定為優勢厭氧菌，但其數量較低，為好氧菌的萬分之一，表明B.cereus的生長可能受到抑制。如從一個韓國醬中分離的一株B.subtilis HJ18-4，其生長能夠有效抑制病原性的B.cereus生長[17]。所以，該蠶豆醬中，B.cereus保持在較低水平的原因有待進一步分析。另外，一些豆瓣醬中，分離的厭氧菌包括一些乳酸菌，但該蠶豆醬則不含乳酸菌。這可能與好氧芽孢桿菌的大量存在相關，或者是乳酸菌的生長在蠶豆醬發酵過程受到抑制。

3 結語

作者分析了安慶某蠶豆醬傳統發酵過程中細菌菌群的動態變化。應用菌株專一性的Rep-PCR指紋技術，能夠快速區分平板分離的細菌菌落，從而定量分析優勢菌群的菌種組成。通過樣品進行指紋圖譜分類，對菌落進行快速分類，選取不同特征指紋類別的菌株進行16S rDNA測序鑒定，極大節約了時間和工作量，同時也減少了研究成本，表明Rep-PCR指紋技術可高效的定量分析混合微生物發酵過程菌種的變化。對蠶豆醬的優勢菌群鑒定結果表明，發酵過程的優勢菌群為芽孢桿菌，不同發酵階段菌群變化主要表現為3種芽孢桿菌比例之間的變化。所以，該蠶豆醬的成熟應與芽孢桿菌的大量生長及發酵相關，進一步研究這三類菌在蠶豆醬發酵過程中的代謝和互作，對揭示豆瓣醬發酵的成熟和風味物質的形成機理有重要的作用。此外，該蠶豆醬釀造過程中，厭氧菌數量少，種類單一，不含乳酸菌，而且前期研究使用其它乳酸菌培養基包括M17培養基、MC培養基、TJA培養基等，均未能在各樣品中檢出乳酸菌。這種傳統發酵的醬醅中不含乳酸菌的現象較少，表明乳酸菌生長受到一定抑制，可能是因為芽孢桿菌的大量生長，或者是因為周圍環境和生產工藝 （比如原料、鹽濃度和翻醬）等，這方面需要進一步研究。這一研究結果也證明醬中濃郁香味的形成，不一定需要乳酸菌參與，應與日光暴曬過程的物理化學反應更密切相關。

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Monitoring the Change in Bacterial Community during Traditional Fermentation of Broad Bean Sauce

KUAI Hui1，2， ZHU Linjiang1，2， LIU Chunfeng1，2， LI Qi*1，2
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Dynamic change of microorganismsin the process oftraditional fermentation of broad bean saucehas an important effecton the maturity，flavor formation and food safety of the product.To quantitatively analyze the dynamic changes of bacterial species during traditionalsunshineexposedfermentation of broad bean sauce，strain-specific Rep-PCR fingerprinttechnology was adopted.The dominant strains were identified.Results indicated that during the traditional fermentation process，the total number of aerobic bacteria remained at a higher level（107～108CFU/g），mainly including Bacillus subtilis，B.amyloliquefaciens and B.methylotrophicus.The total number of facultative anaerobe was 103～104CFU/g and composed of B.cereus.At the early stage ofthe fermentation，B.subtiliswas the dominant bacteria and accounted for more than 80%，while the content of B.amyloliquefaciens and B.methylotrophicus increasedat the later period of fermentation. Therefore，Bacilli played a major role in the traditional fermentation of the broad bean sauce.The identified B.cereuswas related to the open fermentation mode.By comparison to aerobic bacteria，The number of B.cereuswaskept at a low level，which guarantees the safety of the traditionally fermented food.

broad bean sauce，traditionalfermentation，bacteria，dynamic change，Rep-PCR fingerprintidentificationtechnology

TS 264

A

1673—1689（2017）03—0271—06

2015-01-22

國家863計劃項目（2013AA102106）；中央高校基本科研業務費項目（JUSRP51402A，JUDCF13008）；江蘇高校優勢學科建設工程項目；江蘇省111引智計劃項目（111-2-06）。

*通信作者：李 崎（1971—），女，上海人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事啤酒釀造及傳統釀造方面的研究。

E-mail：liqi@jiangnan.edu.cn

蒯輝，朱林江，劉春鳳，等.蠶豆醬傳統釀造過程中細菌菌群的動態變化[J].食品與生物技術學報，2017，36（03）：271-276.