共表達磷脂酶C促進葡萄糖異構酶在大腸桿菌中的胞外表達

姜 琪， 宿玲恰， 吳 敬， 陳 晟

（食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122）

共表達磷脂酶C促進葡萄糖異構酶在大腸桿菌中的胞外表達

姜 琪， 宿玲恰， 吳 敬， 陳 晟*

（食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122）

磷脂酶C（PLC）能夠水解細胞膜主要成分磷脂，使細胞膜通透性增強，從而能夠釋放出胞內物質。作者構建了PLC與天然胞內定位蛋白葡萄糖異構酶（GI）共表達的重組大腸桿菌，搖瓶發酵胞外上清液中GIC酶活達到3.4 U/mL，占胞外和胞內總酶活的93%，表明GIC成功實現了胞外表達。將胞外上清液中的GIC進行分離純化和酶學定性，發現其比活為12.1 U/mg，最適反應溫度為80℃，最適pH為10，均與對照菌單獨表達的GIO性質基本一致。在此基礎上，對上述重組菌進行3 L發酵罐培養，發酵周期為24 h，酶活達到17.7 U/mL，表明其良好的工業化放大生產前景。

磷脂酶C，葡萄糖異構酶，共表達，胞外表達

大腸桿菌表達系統作為目前研究最深入和應用最廣泛的表達系統，具備遺傳背景清晰、細胞結構簡單、蛋白質表達效率高、培養周期短、操作簡便等天然優勢，是規?；苽渲亟M蛋白的首選表達系統之一[1-2]。大腸桿菌具有兩層細胞膜結構，這一特點決定了蛋白質的定位方式除了膜定位外，還有胞內定位、周質空間定位和胞外基質定位。重組蛋白質分泌至周質空間或者胞外基質比定位于胞內更有助于蛋白質折疊、減少包涵體的形成、降低胞內雜蛋白質的污染以及簡化下游分離提取過程，而胞外基質定位蛋白質的分離過程只需離心過濾除去細胞即可，在大規模生產生物制品中具有較大優勢[3-4]。

對于胞內蛋白質來說，通常連接信號肽也無法利用宿主菌蛋白質轉運系統實現胞外分泌，因此只能通過破碎細胞來獲取。常用的方法有機械法，包括高壓勻漿破碎、超聲波破碎等；非機械法，包括滲透壓沖擊破碎、凍融破碎，另外還有化學法破碎等。此外，還有研究者采用共表達一些噬菌體來源的溶解細胞蛋白實現蛋白質的釋放[5-7]。這些使細胞完全裂解破碎的方法在過程中無法避免的釋放出細胞內蛋白質、核酸、多糖等雜質，這些雜質會給下游的分離提取過程帶來不利影響。

本實驗室前期研究表明[8]，角質酶具有磷脂酶B的水解活性，當其在胞內重組表達時能夠有限的水解細胞膜磷脂組分，在一定程度上對細胞膜形成破壞，提升其通透性，從而使內容物能夠非正常釋放，但不會引起細胞裂解，因此能夠通過與角質酶共表達實現胞內目的蛋白質胞外表達的目的。然而，由于角質酶催化磷脂水解的作用位點為磷脂分子中1位和2位酯鍵[9]，其產物之一是溶血磷脂，屬于較強的表面活性劑，導致在發酵過程中大量起泡，不利于發酵調控和工業放大。

磷脂酶C （phospholipase C，PLC，EC3.1.4.3）是一種水解甘油磷脂C3位點磷酯酰鍵生成甘油二酯和磷酸膽堿、磷酸肌醇或磷酸乙醇胺等的水解酶[10]，有報道[11]中提到Bacillus cereus來源的磷脂酶C（PLC）同樣對細胞存在一定毒性。作者所在實驗室前期工作構建了Bacillus cereus來源的磷脂酶C在大腸桿菌中重組表達的工程菌，研究表明，其能夠在不引起細胞裂解的情況下通過對細胞膜磷脂的部分水解提升膜透性，并且能夠避免角質酶促進蛋白質胞外表達過程中易起泡的缺陷。

葡萄糖異構酶（glucoseisomerase，GI，EC5.3.1.5），又稱木糖異構酶，能將葡萄糖、木糖、核糖等醛糖催化異構為相應的酮糖[12]。目前其主要應用領域為將葡萄糖轉化為果糖從而制備果葡糖漿。葡萄糖異構酶來源廣泛，包括近百種細菌和放線菌[13]，其中絕大部分為胞內酶，研究者在進行其重組表達時通常采取胞內定位的形式。作者所在實驗室前期構建了Thermobifida fusca來源的葡萄糖異構酶在大腸桿菌中重組表達的基因工程菌，研究表明其酶學特性和應用性能良好，具備良好的工業化應用潛力[14]。

作者研究了通過共表達B.cereus來源的磷脂酶C（PLC）和T.fusca來源的葡萄糖異構酶，考察磷脂酶C是否能夠通過限制性地破壞細胞膜促使葡萄糖異構酶的胞外“釋放”，并考察在這一過程中，葡萄糖異構酶是否發生折疊不正常、性質改變等問題。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

E.coli JM109、BL21（DE3）菌株、葡萄糖異構酶胞內表達的重組E.coli BL21（DE3）及分別帶有磷脂酶C和葡萄糖異構酶基因的重組質粒pETDuet/plc和pET24a/glu：作者所在實驗室保藏。

1.2 試劑與培養基

限制性內切酶NdeⅠ、XhoⅠ，堿性磷酸酶（calf intestine alkaline phosphatase，CIAP），T4DNA連接酶，DNA Marker及瓊脂糖：寶生物工程（大連）有限公司；質粒小提試劑盒及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒：天根生化科技有限公司；異丙基硫代-β-D半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）和氨芐青霉素（ampicillin，Amp）：生工生物工程（上海）股份有限公司；分子級酵母粉和胰蛋白胨：英國Oxoid公司；其它試劑：均為國產分析純試劑，上海國藥集團化學試劑有限公司。

LB液體培養基 （g/L）：酵母粉 5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0。

LB固體培養基：LB液體培養基中添加1.5～2.0 g/dL的瓊脂。

TB培養基（g/L）：甘油5.0，胰蛋白胨12.0，酵母粉24.0，K2HPO4·3H2O 16.4，KH2PO42.3。

LB（TB）-Amp培養基：在滅菌后的LB（TB）培養基中添加終質量濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素。

3 L罐發酵培養基 （g/L）：甘油 8.0，KH2PO413.5，（NH4）2HPO44.0，檸檬酸1.7，MgSO4·7H2O 1.4，微量元素液 12.0 mL，工業級酵母粉2.4，工業級蛋白胨1.2，調pH 7.0。

微量元素液 （g/L）：FeSO4·7H2O 10.0，ZnSO4· 7H2O 5.25，CuSO4·5H2O 3.0，MnSO4·4H2O 0.5，Na2B4O7·10H2O 0.23，CaCl22.0，（NH4）6Mo7O240.1。

補料液 （g/L）：甘油 600，MgSO49.0，工業級酵母粉2.4，工業級蛋白胨1.2。

1.3 方法

1.3.1 大腸桿菌表達質粒的構建 提取作者所在實驗室保藏的重組質粒pET24a/glu及pETDuet/plc，經NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切，割膠回收獲得glu基因及線性化的pETDuet/plc載體，16℃連接過夜，轉化E.coli JM109感受態細胞，氨芐青霉素抗性平板篩選。獲得的轉化子提取質粒經NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切驗證正確，即質粒pETDuet/plc/glu。將驗證正確的pETDuet/plc/glu質粒轉化E.coli BL21（DE3）感受態細胞，氨芐青霉素抗性平板篩選，-80℃甘油管保存。

1.3.2 重組菌誘導表達 將葡萄糖異構酶和磷脂酶C共表達的重組菌（以下簡稱共表達菌）與葡萄糖異構酶單獨表達的對照重組菌 （以下簡稱對照菌）置于LB培養基中，37℃、200 r/min振蕩培養8～10 h，以5%接種體積分數轉接至TB培養基中，25℃、200 r/min培養6 h后加入IPTG，至終濃度為0.1 mmol/L，繼續在25℃、200 r/min培養至發酵液中GI酶活不再上升。

1.3.3 葡萄糖異構酶純化及SDS-PAGE凝膠電泳檢測

1）前處理：將共表達菌發酵液離心收集上清液。對照菌發酵液離心收集菌體，菌體用適量30 mmol/L磷酸鹽緩沖液（Na2HPO4-KH2PO4，pH 7.5）復溶，超聲破碎細胞，離心收集上清液。將上述收集的共表達菌發酵上清液和對照菌破壁上清液于75℃處理15 min，離心，收集上清液。

2）硫酸銨沉淀：在經過前處理的上清液中緩慢加入70 g/dL硫酸銨，鹽析過夜，4℃、8 000 r/min離心30 min；用適量緩沖液A（30 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4，pH 7.5）將沉淀充分溶解，4℃透析過夜，經膜過濾后即為上樣樣品。

DEAE-Sepharose陰離子交換柱用緩沖液A平衡后上樣，依次用緩沖液A、含0～1 mol/L NaCl的緩沖液A、含1 mol/L NaCl的緩沖液A洗脫結合蛋白質，流速為1 mL/min。收集有酶活力組分進行酶活測定和蛋白質電泳分析。

1.3.4 酶活力檢測方法 葡萄糖異構酶活力檢測方法：以3 mol/L的葡萄糖溶液為底物，葡萄糖異構酶將底物異構化為果糖，進而采用咔唑-硫酸法測定果糖含量。異構反應為：0.1 mL的3 mol/L葡萄糖溶液，0.1 mL的50 mmol/L的MgSO4，0.1 mL的300 mmol/L pH 7.5 Na2HPO4-KH2PO4緩沖液，0.6 mL H2O混勻，70℃預熱5 min，加入0.1 mL適當稀釋的酶液（以水作空白），準確反應10 min后，立即用1 mL的0.5 mol/L HClO4終止反應。顯色反應：將上述反應液稀釋一定倍數后取0.5 mL加入到比色管中，再分別加入0.1 mL半胱氨酸鹽酸鹽溶液，3 mL 75%的H2SO4和0.1 mL咔唑-酒精溶液，振蕩混勻后置于60℃水浴中反應10 min。置于冰浴冷卻至室溫后，于560 nm處測定吸光度（空白為以水代替反應液）。

酶活力單位定義：在上述反應條件下，每分鐘生成1 μmol果糖所需的酶量為一個活力單位（U）。1.3.5 重組菌株生長曲線測定 從甘油管中接種共表達菌及對照菌于LB培養基中，37℃、200 r/min培養8～10 h，5%接體積分數轉接于TB培養基中，37℃、200 r/min培養，定時取樣測定OD600nm值及酶活力，做2組平行實驗。

1.3.6 重組GI最適溫度及最適pH測定 其他條件不變，分別在55、60、65、70、75、80、85、90℃測定純化共表達重組GI酶活，以酶活最高的為100%。

其他條件不變，分別測定pH 5.5～12之間的酶活，以酶活最高的為100%。

1.3.7 3 L發酵罐培養方法 從甘油管中吸取100 μL菌液，接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素的工業級LB培養基（裝液量50/250 mL）中，37℃、200 r/min培養8 h。將種子以10%的接種體積分數接入Infors 3 L全自動發酵罐中，初始裝液量1.2 L。誘導前培養溫度37℃、pH 7.0，溶氧20%。當發酵初始碳源甘油基本消耗完時，開始流加補料液；流加方式為指數流加，比生長速率控制在μ=0.2 h-1[15]。當菌體干重約為7.5 g/L左右時，加入甘氨酸，加量為10 g/L；菌體干重約為25 g/L左右時，開始誘導，誘導方法為恒速流加乳糖，乳糖加量0.2 g/（L·h）。開始誘導后，每3小時取樣一次，測定菌體干重和培養基中酶活變化，培養基中酶活不再上升時，發酵過程結束。

2 結果與討論

2.1 重組表達質粒的構建

分別提取 pETDuet/plc質粒及 pET24a/glu質粒，經NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切，pETDuet/plc酶切之后再用CIAP去磷酸化處理以防止自連，目的片段回收后用T4DNA連接酶于16℃連接過夜，轉化E.coli JM109感受態細胞，氨芐青霉素抗性平板篩選。獲得的轉化子提取質粒經NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切驗證，得到目的條帶，見圖1。重組質粒pETDuet/plc/glu構建成功。

圖1 重組質粒pETDuet/plc/glu NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切電泳圖Fig.1 Restriction enzyme digestion analysis of pETDuet/ plc/glu by NdeⅠand XhoⅠ

bp

2.2 重組葡萄糖異構酶在大腸桿菌中的表達

將驗證正確的重組質粒pETDuet/plc/glu轉化感受態細胞E.coli BL21（DE3），篩選獲得轉化子，將該轉化子與實驗室前期構建的單獨表達GI菌株按照上述1.3.2節方法進行誘導培養，結果見圖2。共表達菌（以下簡稱共表達GI為GIC）與對照菌（以下簡稱單獨表達GI為GIO）生長情況相似，在發酵過程的前8個小時，共表達菌培養基中檢測不到GIC酶活，推測可能是此時PLC對細胞的破壞作用尚未達到能夠使GIC滲漏的程度。發酵8 h后，隨著時間的增加，培養基中GIC酶活逐漸增加，直至24 h，隨著時間的推移酶活幾乎不增長，發酵過程結束，此時培養基中GIC酶活達到3.4 U/mL，胞內酶活約為0.3 U/mL，GIC總酶活為3.7 U/mL，因此釋放至胞外的酶活約占總酶活的93%。蛋白質電泳結果見圖3。共表達菌培養基上清組分中在43 000處有明顯的條帶，與GI理論相對分子質量一致，表明與PLC共表達時，GI被高效釋放到胞外上清液基質中。此外，對照菌發酵過程結束，酶活達到4.2 U/mL，共表達菌與對照菌葡萄糖異構酶表達量區別不大。

圖2 共表達菌和對照菌發酵過程生長和產酶曲線Fig.2 Growth and enzyme production by recombinant E.coli BL21（DE3）

2.3 重組蛋白質的純化及定性

當GI與PLC共表達時，PLC破壞細胞膜，GI被釋放到培養基中的過程是細胞非自然生長狀態下滲漏的結果。在這一過程中，可能伴隨著GI折疊不完全、結構松散、酶學性能改變等現象。為了考察這些現象是否存在，對GIC進行了分離純化，并檢測了最適溫度、最適pH、比活等性質，與實驗室保存的GIO純品性質進行比較。

圖3 重組菌搖瓶發酵胞外上清液SDS-PAGE電泳分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of culture supernatant of recombinant strains

根據前述1.3.3節方法對粗酶液進行分離純化。經歷了兩步純化后，結果見圖4，達到電泳純。最終獲得純酶GIC比活11.9 U/mg，與作者所在實驗室純化GIO比活12.1 U/mg相近，見表1。

圖4 純酶GICSDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified GIC

表1 GIC純化過程參數Table 1 Purification scheme of recombinant GIC

獲得GIC純酶后，分別測定GIC和GIO純酶最適溫度和最適pH，分別選擇溫度范圍55～90℃和pH范圍5.5～12進行實驗，結果見圖5。GIC最適溫度為80℃，最適pH為10.0，與GIO一致。且二者隨著溫度和pH值變化，殘留酶活百分比趨勢基本一致。

圖5 溫度和pH對GIC和GIO酶活的影響Fig.5 Effects of temperature and pH on activity of GICand GIO

與磷脂酶C共表達的葡萄糖異構酶和單獨表達的葡萄糖異構酶在比活、最適溫度、最適pH等性質方面沒有明顯差別，表明在共表達的過程中，葡萄糖異構酶在被釋放出細胞前已經正確地完成了整個蛋白質合成過程，并且不存在折疊不完全等異常情況。

2.4 磷脂酶C與葡萄糖異構酶共表達菌株3 L罐小試

為了考察葡萄糖異構酶與磷脂酶C的共表達是否能夠應用于工業生產，用菌株pETDuet/plc/glu進行3 L發酵罐培養。按照1.3.7節所述方法進行pETDuet/plc/glu菌株的3 L罐小試。接罐后約6.5 h，培養基中的甘油耗盡，開始補料。采用指數流加法進行流加補料，細胞干重約為25 g/L時，開始流加乳糖誘導。誘導開始后，每3小時取樣一次，結果見圖6。培養基中的酶活和細胞干重隨著誘導時間的延長逐漸增加。當乳糖誘導約為18 h時，細胞干重不再明顯增加；當乳糖誘導約為24 h時，培養基中酶活不再明顯增加，此時酶活達到了17.7 U/mL，是搖瓶發酵菌株培養基酶活的5.2倍，釋放到培養基中的酶活比例約為85%，電泳結果見圖7。

圖6 3 L罐小試菌體干重變化和產酶曲線Fig.6 Growth and enzyme production by recombinant E.coli BL21（DE3）under the fermentation condition

對重組磷脂酶C和葡萄糖異構酶共表達的菌株進行的搖瓶發酵和3 L罐小試結果說明，葡萄糖異構酶成功實現了胞外表達，并且這一過程具有表達效率高、發酵過程易調控、后期分離純化簡便等優勢，有利于工業化制備葡萄糖異構酶。

圖7 3 L罐小試GIC蛋白質電泳圖Fig.7 SDS-PAGE analysis of extracellular fraction under the fermentation condition

3 結語

本研究通過共表達對細胞膜有傷害作用的磷脂酶C成功實現了天然胞內蛋白葡萄糖異構酶的胞外表達，并且獲得了較高的表達效率。然而過程中的一些實驗條件包括發酵條件等只是初步的探究，并未進行深入的優化，仍然存在進一步發掘的潛力。在未來的研究中，可以進一步優化實驗工藝，尤其是發酵工藝，以獲得更高的胞外酶活、更好的分泌效率以及更短的發酵周期等，為葡萄糖異構酶工業化規模制備奠定基礎。

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Co-Expression of Phospholipase C and Glucose Isomerase Which Promoting the Extracellular Expression of Glucose Isomerase in E.coli

JIANG Qi， SU Lingqia， WU Jing， CHEN Sheng*
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，JiangNan University，Wuxi 214122，China）

Phospholipase C（PLC）hydrolyzes the phospholipids in the membrane.The hydrolysis was partial，which would enhance the cell membrane permeability，and then proteins in the cytoplasm were released into culture medium.In this study，PLC was co-expressed with glucose isomerase（GI）.In shake flask fermentation of recombinant E.coli BL21（DE3），the activity of GICin culture supernatant was 3.4 U/mL，which was 93%of the total enzyme activity in culture supernatant and cytoplasm.GICwas released into culture medium.The GICwas purified and characterized.The specific activity of GICwas 12.1 U/mg，the optimum temperature was 80℃，and the activity of GICwas maximal at pH 10.The characteristics of GICwere similar to GIO，In addition，The enzyme activity reached 17.7 U/mL in 24 hours by utilizing fed-batch strategy in 3 L fermentor.

phospholipase C，glucose isomerase，co-expression，released into culture medium

Q 814

A

1673—1689（2017）03—0236—07

2015-03-06

國家杰出青年基金項目（31425020）；江蘇省自然科學基金項目（BK20140132）。

*通信作者：陳 晟（1981—），女，江蘇常州人，工學博士，副教授，碩士研究生導師，主要從事工業微生物、酶工程、發酵工程與技術方面的研究。E-mail：chensheng@jiangnan.edu.cn

姜琪，宿玲恰，吳敬，等.共表達磷脂酶C促進葡萄糖異構酶在大腸桿菌中的胞外表達[J].食品與生物技術學報，2017，36（03）：236-242.