內毒素定量檢測儀的研究*

向天雨，王惠來

(重慶醫科大學附屬大學城醫院 401331)

·技術與方法·

內毒素定量檢測儀的研究*

向天雨，王惠來△

(重慶醫科大學附屬大學城醫院 401331)

目的 利用壓電晶體在液相環境中阻尼效應(非質量效應)，研究能定量、高靈敏度、低檢測限、快速的內毒素生物傳感檢測系統。方法 通過對石英晶體傳感探頭表面的光滑處理和親水性處理得到性能(消除質量負載影響、提高液固偶合效應)更好的傳感器探頭，提高測量的穩定性和重復性，降低測量的檢測下限。利用CPLD器件和LabView軟件將整個測量系統做成一種微型的自動化的內毒素檢測系統，實現測量數據的自動采集、分析和結果顯示。結果 不同濃度的內毒素與頻移最終穩定值存在良好的線性關系。結論 通過建立的頻移數據，能夠準確、方便地得到內毒素濃度。

內毒素類；壓電石英晶體；傳感器；鱟試劑；特征值

內毒素是革蘭陰性桿菌生長時釋放或死亡時裂解出來的細胞壁脂多糖(LPS)成分[1]，極低濃度的內毒素就會影響某些細胞的正常生理活動，導致人體或動物嚴重的炎癥反應[2]。重癥革蘭陰性菌感染引起的內毒素血癥、全身炎癥反應綜合征(SIRS)、多臟器功能衰竭綜合征，其病死率一直居高不下[3]。造成患者最后的死亡在一定程度上是由于缺乏可靠、快速和準確的內毒素濃度檢測，以便迅速采取合理的治療措施。近年來國內外報道革蘭陰性菌感染有逐年增加的趨勢，故快速診斷革蘭陰性細菌所致的敗血癥和內毒素血癥已被越來越重視。內毒素定量檢測不僅有助于鑒別是否為細菌感染，還能提示感染嚴重程度，具有極其重要的臨床價值[4]。目前內毒素檢測方法主要以鱟實驗法(LT)為主[5]，存在費時、定量性差、操作繁瑣、自動化程度低及受主觀因素影響大等缺點[6]?；诠鈱W原理的內毒素測量方法克服了上述缺點，但同時也存在諸如體積大需要復雜的裝置，或者需要標記以及智能化程度低等缺點[7]。為了滿足臨床定量檢測內毒素的需求，以及對藥物、水源、食品、醫療器械及生物制品等進行內毒素定量檢測，嚴格控制其內毒素含量[8]，研究一種定量、無需標記、靈敏度高、檢測下限低、便于攜帶的智能型內毒素檢測系統仍是非常有價值的。 本測量系統主要由傳感器、信號處理電路(包括頻率計數器、接口電路、串行通信電路)、測量軟件3部分組成。

1 測量系統的構建

1.1 傳感器部分 設計傳感器振蕩電路、頻率計數器及頻率計數器與計算機接口電路。擬制成的傳感器由傳感探頭(壓電石英晶片)和測量池構成，結構見圖1。

圖1 傳感器結構

這一部分的重點是晶體表面的光滑處理和親水性處理，測量池體積約為0.4 mL，池壁由不銹鋼材料做成。石英晶體一面的塑料蓋用硅橡膠密封。電磁攪拌器是為了防止內毒素在溶液中容易聚集。電極之間有個電阻發熱，保持測量池的溫度在35 ℃左右，在此溫度下的頻率響應最大最快。

1.2 信號處理電路部分 信號處理電路由石英晶體振蕩電路、頻率計數電路和串口通訊接口電路組成，見圖2。其中，振蕩電路采用集成門74LS04組成；頻率計數電路和串口通訊電路采用ALTERA公司的復雜可編程邏輯處理器(CPLD)構建。在MAXPLUSⅡ編程環境下，用Verilog HDL硬件編程語言編程在CPLD中同時實現頻率計數和串口通訊功能。通訊接口電路采用MAX232芯片構成。整個電路由于采用CPLD組成，所以系統非常小巧。適合于攜帶和野外測試。這種系統比傳統的基于單片機的系統具有抗干擾性能好、集成度高以及易于升級等優點。電路中采用高頻變壓器，保證具有很好的穩定性和很強的起振能力。同時采用雙晶片可以抵消外界環境溫度、濕度和電磁干擾，保證測量的穩定性和重復性，見圖3。

圖2 傳感器信息處理電路

圖3 傳感器的振蕩電路

1.3 測量軟件部分 利用LABVIEW 2010集成的大量串口通訊、數據采集、數據處理和數據分析以及實時圖形顯示功能模塊，開發基于圖形化的測量軟件，主要內容包括：串口通訊控制、數據采集、數據平滑、數據濾波、數據微分、數據定時、數據顯示、結果分析等功能塊。LABVIEW由2部分組成：程序前面板(控制面板)、程序框圖。程序前面板主要是設置輸入量和顯示輸出量，且用來模擬真實儀器的前面板；程序框圖采用G編程語言編寫。軟件設計中增加了對傳感器響應內毒素濃度的實時頻率變化曲線的定時捕捉，定頻捕捉，通過曲線的微積分處理、數據的傅立葉變換、平滑、統計等處理從而在頻率響應曲線中尋找出最能體現內毒素濃度的特征信號(特征值)。

2 實驗步驟

2.1 傳感器探頭的處理 由于傳統的石英晶體傳感器檢測系統采用手工記錄的方式，無法獲得傳感器對內毒素的實時動態響應曲線，所以出現標定內毒素濃度與頻率變化關系的不準確和標定方法的單一。本文先對石英晶體電極表面拋光處理，以減小表面的裂縫和凹坑帶來的液體質量負載效應對測量的影響，從而減小誤差；然后進行表面親水性處理，利用金的接觸角大約為78°左右，改變接觸角可以更有利于液固耦合，從而提高測量的靈敏度的特性。本研究通過旋轉涂覆法將聚苯乙烯溶液均勻的涂覆到電極表面，選用聚苯乙烯是因為該材料具有很高的剪切模量。由于聚苯乙烯為疏水性材料，將其放到紫外燈下照射一定時間可以得到親水性很強的表面，通過高溫烘烤即可得到表面更光滑、親水性更好的表面。

2.2 內毒素的配置 實驗中，把內毒素配成濃度為20 ng/mL的溶液然后分別稀釋為以下幾組。10～100 ng/mL，梯度為10 ng/mL；1～10 ng/mL，梯度為1 ng/mL；100 pg/mL～1 ng/mL，梯度為100 pg/mL；10～100 pg/mL，梯度為10 ng/mL；1～10 pg/mL，梯度為1 pg/mL；0.10～1.00 pg/mL，梯度為0.1 pg/mL;0.01～0.10 pg/mL，梯度為0.01 pg/mL。每梯度溶液取0.9 mL，分成3等分，對每一個濃度的樣品做3次實驗進行傳感器的穩定性和重復性的分析，頻移值取其平均值作為測量結果。為了避免上次測量結果對下次測量結果的影響,待頻率穩定后(10～18 min)，在下次測量前均用 0.11 mol/L的鹽酸和去內毒素水清洗3次以確保晶體表面沒有黏附物質。

2.3 數據記錄并處理 將配置好的內毒素溶液分別分次加入到測量池，接通電源觀察并記錄測量系統顯示屏上頻移數據，并把這些不同內毒素濃度與相同量的鱟試劑混合液中傳感器的實時頻率變化曲線中的數據匯成曲線，找出一個最佳量與內毒素濃度的對應關系，并以此制作標定曲線見圖4、5。

圖4 0.01～0.10 pg/mL各濃度的曲線圖

圖5 0.20～1.00 pg/mL各濃度的曲線圖

3 實驗結果及處理

根據頻率實時響應曲線，可以觀察到主要測試參數：各濃度內毒素引起的頻移最后穩定在一個特殊值；頻移穩定值對應一個特定的檢出時間；在內毒素濃度大于0.10 pg/mL時，頻移最終穩定值與弄存在良好的線性關系；在濃度低于0.10 pg/mL一下時，最終的頻移都穩定在7 000左右，所以此時用最終頻移穩定值無法定量測量濃度，而且時間很長。在不考慮時間的情況下，只考慮頻移與濃度的關系，見圖6、7。

圖6 濃度范圍在0.01～0.10 pg/mL濃度與頻移的關系圖

圖7 濃度范圍在0.20～1.00 pg/mL濃度與頻移的關系圖

4 結 論

根據各區段濃度與頻移的折線圖可以看出，濃度和頻移在誤差范圍內存在很好的線性關系。通過實驗手段，建立不同濃度的內毒素對應的頻移最終穩定值的對應關系。通過軟件部分，把這種關系通過圖形化的可視化界面展現出來，在實際測量中就能實現快速、準確，智能化的得到待測的值。所以，本檢測系統基本上是一款具有定量、無需標記、靈敏度高、檢測下限低、便于攜帶特點的智能型內毒素檢測系統，能夠滿足臨床的需要，也能滿足其他各行各業對內毒素的檢測[9-10]。

[1]Fujita Y,Tokunaga T,Kataoka H.Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test[J].Anal Biochem,2011,409(1):46-53.

[2]Ochiai M,Yamamoto A,Naito S,et al.Applicability of bacterial endotoxins test to various blood products by the use of endotoxin-specific lysates[J].Biologicals,2010,38(6):629-636.

[3]盛鳳仙，熊可強，王惠之，等．動態濁度法鱟試驗用于檢測人凝血因子Ⅷ制品中細菌內毒素的研究[J]．藥學實踐雜志，2012，30(2)：107-114．

[4]王紅芳，王捧英，施靖，等．細菌內毒素的臨床生物學作用及其拮抗劑研究進展[J]．河北醫藥，2013，35(5)：759-761．

[5]周筱莉.我國細菌內毒素檢查法的應用進展[J].中國醫藥導報,2010,7(23)：232-236．

[6]邱娟，盛振斌.細菌內毒素檢查法的應用進展[J].臨床合理用藥雜志,2011,4(9)：128-129．

[7]肖鯤,李建華,吳文靜,等.態動濁度法檢測細菌內毒素試驗假陽性結果原因分析[J].中國輸血雜志，2012，6(3)：115-118．

[8]李榮，吳玲.動態濁度法檢測乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液中的細菌內毒素[J].中國藥房，2012，8(9)：189-192．

[9]許海彥，張君成，徐巍巍，等．羅庫溴銨注射液細菌內毒素的檢查[J]．煤炭與化工,2010,33(4):59-61．

[10]陳丹丹．過濾和離心對熱原實驗影響的初步研究[J]．生物醫學工程與臨床，2011,15(5):417-419．

Study on endotoxin quantitative detector*

XiangTianyu,WangHuilai△

(University-TownHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing401331,China)

Objective To develop a quantitative,highly sensitive,low detection limit and fast endotoxin(ET) biosensing detection system by utilizing the piezoelectric crystal′s damping effect(non-mass effect) in the liquid phase environment.Methods The sensor probe of better performance (eliminating the quality load effects and improving the liquid-solid coupling effect) was obtained by using the smoothing processing and hydrophilic processing of a quartz crystal sensor probe surface,thus the stability and repeatability of measurement were increased and the low detection limit of measurement was decreased.The whole measurement system was made into a miniature and automated endotoxin detection system by using CPLD device and LabView software to realize the automatic collection,and analysis and results display of measurement data.Results The good linear relationship existed between different concentrations of endotoxin and the stable value of frequency shift.Conclusion By the established data of frequency shift,the endotoxin concentration can be obtained accurately and conveniently

endotoxins;piezoelectric quartz crystal;sensor;limulus reagent;eigenvalue

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.11.021

渝中區科學技術委員會科技攻關項目(20110205)；渝中區科委科技服務民生項目(20110606)。 作者簡介：向天雨(1974-)，副教授，博士，主要從事醫學信息技術的研究。△

,E-mail:804225405@qq.com。

Q819

A

1671-8348(2017)11-1506-02

2016-12-19

2017-02-15)