宮頸錐形切除術后宮頸組織中TNF-α、IL-6、HMGB1的表達及其意義研究*

殷新明，朱小蘭，溫 堅，朱 莉，談微微，劉頌平

(江蘇大學第四附屬醫院暨鎮江市婦幼保健院婦科，江蘇鎮江 212001)

論著·臨床研究

宮頸錐形切除術后宮頸組織中TNF-α、IL-6、HMGB1的表達及其意義研究*

殷新明，朱小蘭，溫 堅，朱 莉，談微微，劉頌平

(江蘇大學第四附屬醫院暨鎮江市婦幼保健院婦科，江蘇鎮江 212001)

目的 探討宮頸錐形切除術后宮頸分泌物及宮頸組織中炎性因子的動態變化及其意義。方法 選取2013-2015年在該院就診的行宮頸錐形切除術患者，術后定期采集宮頸創面分泌物及周圍組織，定量檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、高遷移率族蛋白1(HMGB1)的表達，以術前作為對照組，進行統計分析。觀察宮頸錐形切除術后行全子宮切除的標本中炎性細胞的浸潤及表達。結果 宮頸組織及分泌物中TNF-α、IL-6、HMGB1的表達在宮頸錐形切除術后逐漸升高，術后1～2周達到高峰，與術前比較差異有統計學意義(P<0.05)，之后逐漸下降。在宮頸錐形切除術后1周行全子宮切除的標本病理顯示，炎性細胞浸潤及炎癥反應最嚴重；其TNF-α、IL-6及HMGB1表達較術后4周明顯升高。結論 宮頸錐形切除術后1～2周時宮頸創面炎癥最為嚴重，應避免在此階段行全子宮切除。

子宮頸錐形切除術后；子宮切除術；腫瘤壞死因子α；白細胞介素6；高遷移率族蛋白質類；術后感染

在宮頸上皮內瘤變Ⅲ級和子宮頸浸潤癌Ⅰa1期患者的處理過程中，宮頸錐形切除術是其診斷和治療的重要環節。接受宮頸錐形切除術的部分患者中后續需行全子宮切除術。本文連續檢測宮頸錐形切除術后宮頸組織及分泌物中腫瘤壞死因子-α (tumornecrosis factor-a，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukiw6，IL-6)、高遷移率族蛋白1(high-mobility group box 1 protein， HMGB1)表達的消長情況，為宮頸錐形切除術后行全子宮切除的手術時機及安全性提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013-2015年在本院就診的行宮頸錐形切除術患者36例。分為A組(術前)，B組(術后48 h)，C組(術后1周)，D組(術后2周)，E組(術后3周)，F組(術后4周)，G組(術后6周)。本研究通過本院倫理委員會審批，患者及家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 分泌物：均用一次性宮頸采樣刷刷取宮頸(術前)或宮頸創面(術后)兩圈，將刷子放入裝有1 mL Trizol的小管中，涮20次，如陰道內有液體取材前用棉球拭去。組織標本：手術前活檢鉗鉗取手術野外周圍組織，手術后取創面外周圍組織2塊，放入裝有1 mL Trizol的小管,置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 實驗方法 (1)分泌物及組織總 RNA的提取。(2)逆轉錄反應。(3)標準質粒的構建，采用普通PCR擴增TNF-α、IL-6、HMGB1和β-actin基因，引物序列見表1。(4)于術前、術后48 h及術后1、2、3、4、6周分別取患者宮頸分泌物及宮頸組織，熒光實時定量PCR法檢測分泌物及組織中TNF-α、IL-6、HMGB1表達。(5)宮頸錐形切除術后行全子宮切除，HE染色下觀察炎性細胞的浸潤情況；免疫組織化學法比較宮頸錐形切除術后1周、4周行全子宮切除TNF-α、IL-6、HMGB1的表達。

表1 各引物序列表

1.3 統計學處理 采用Graphpad Prism 5軟件對數據進行統計分析并制圖，兩組間計量資料比較用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 宮頸分泌物中TNF-α、IL-6、HMGB1的表達比較 術后TNF-α表達逐漸升高，術后1周最高，之后逐漸降低；A組與C組比較差異有統計學意義(P<0.05)，與其余各組比較差異無統計學意義(P>0.05)。IL-6、HMGB1表達術后1周最高，A組與C組、D組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，與其余各組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.2 宮頸組織中TNF-α、IL-6、HMGB1的表達比較 TNF-α表達在術后逐漸升高，術后1周最高；A組與C組、D組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，與其余各組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。IL-6表達在術后逐漸升高，術后1周最高；A組與C組、D組、E組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，與其余各組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。HMGB1表達術后2周最高，A組與C組、D組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，與其余各組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

A:TNF-α；B：IL-6；C：HMGB1。

圖1 宮頸分泌物中TNF-α、IL-6、HMGB1的表達

A:TNF-α；B：IL-6；C：HMGB1。

圖2 宮頸組織中TNF-α、IL-6、HMGB1的表達

2.3 病理標本 CINⅢ級發生于移行帶(鱗柱交界)；CINⅢ級異型的鱗狀上皮累及全層，腫瘤細胞缺乏分化，異型顯著、核漿比高及全層核分裂象可見，見圖3。炎癥反應輕微，間質內血管擴張，上皮組織全部切除，見圖4A；炎癥反應顯著，大量中性粒細胞、淋巴、漿細胞浸潤，表面見較多炎性滲出，上皮組織完全切除(高倍)，見圖4B；炎癥細胞數量減少，表面少許炎性滲出，間質輕度水腫，見圖4C；炎癥細胞進一步減少，間質纖維化，見圖4D；鱗狀上皮恢復，伴少許炎性細胞浸潤，見圖4E；炎癥細胞稀少，部分區域為修復性鱗狀上皮覆蓋，見圖4F；間質內見散在炎癥細胞，出現成熟性修復性鱗狀上皮，見圖4G。

2.4 宮頸錐形切除術后1周、4周行全子宮切除標本中TNF-α、IL-6、HMGB1的表達 宮頸錐形切除術后1周行全子宮切除術標本中三者的表達均高于術后4周。見圖5。

圖3 標本病理(×200)

A:術后48 h；B：術后1周；C：術后2周；D:術后3周；E:術后4周；F:術后5周；G:術后6周。

圖4 各組HE染色(×200)

圖5 術后1周、4周行全子宮切除IL-6、TNF-α、HMGB1免疫組織化學(×200)

3 討 論

細胞因子是多種細胞所分泌的，能調節細胞生長分化、調節免疫功能、參與炎癥發生和創傷愈合等小分子多肽的統稱。TNF-α、IL-6、HMGB1等促炎細胞因子在生物損傷和炎癥反應的發生、發展的病理過程中扮演重要的角色[1]。TNF-α由單核巨噬細胞產生，有免疫調節、參與發熱和炎癥發生的功能，參與全身炎癥反應并在調控炎癥反應急性期中起著重要的作用[2]。TNF-α 等炎癥因子在膿毒血癥早期迅速升高并達到峰值，并且TNF-α升高程度與患者病情嚴重程度有關[3]。Zhao等[4]認為TNF-α在生殖道感染中發揮著重要作用。Su等[5]認為IL-6是多功能炎性細胞因子，是炎性介質網絡的關鍵成分，在炎癥反應中起重要作用，IL-6可作為細菌性感染早期的標志物且優于降鈣素原。楊龍等[6]對顱內感染患者進行動態監測，認為IL-6與顱內感染的發生及患者預后密切相關，可作為判斷患者病情及預后的指標。陳凱[7]認為嚴重燒傷患者的血漿TNF-α、IL-6水平與燒傷程度呈正相關，其活性持續維持在高水平可能與患者發生膿毒血癥及多系統器官功能衰竭(MODS)密切相關。張力等[8]通過對口腔頜面部手術后感染進行分析，發現術后感染患者的血清中炎癥因子IL-6、TNF-α等水平明顯升高。HMGB1是含量豐富的非組蛋白核蛋白，釋放到胞外作為致炎細胞因子是在對內毒素血癥和膿毒癥的研究中發現的。奉有才等[9]研究認為，在炎癥作用下細胞核內 HMGB1通過包膜釋放到細胞外，激活機體的免疫反應和炎癥反應，引起單核巨噬細胞釋放促炎因子，并促進HMGB1的釋放，從而引起炎癥放大和加重。臨床研究顯示，膿毒血癥患者的血清中HMGB1水平明顯高于健康人，HMGB1蛋白質在炎癥后期或膿毒癥中發揮重要的作用[10]。陳曉林等[11]認為HMGB1在膿毒癥大鼠小腸組織中的表達升高，并與大鼠膿毒癥的嚴重性相關。

關于宮頸錐形切除術后何時可以行后續的全子宮切除目前尚無定論。韓秀琴等[12]認為宮頸錐形切除后，盆腔通常有炎性反應和充血，創面滲液較多，常出現發熱。Li等[13]在研究中發現，宮頸錐形切除術后48 h至術后6周行全子宮切除并發癥明顯高于術后48 h內及術后6周后行子宮切除者和無宮頸錐形切除的子宮切除患者。譚先杰等[14]對宮頸錐形切除術后48 h至術后6周和術后6周后再次行子宮切除患者的術后體溫等因素進行比較，認為宮頸錐形切除后再次手術一般應在術后6周后。但有學者認為[15]，不論宮頸錐形切除與隨后子宮切除術或子宮根治術的時間間隔如何，術后的臨床情況均無顯著性差異，可以在患者狀態良好的任何時間行子宮切除術，并非一定在宮頸錐形切除術后48 h內或6周以后。筆者在臨床工作中發現，宮頸錐形切除后1～2周行子宮切除的患者手術并發癥及術后感染均高于其他時間段患者，并出現嚴重的尿路感染、腸道感染和陰道殘端感染出血，而宮頸錐形切除術后4周為患者進行子宮切除術，臨床并發癥及術后感染明顯減少，未出現明顯腸道、泌尿道感染及陰道殘端出血[16]。

本研究發現，顯微鏡下宮頸錐形切除術后1周行全子宮切除宮頸組織炎性因子浸潤，TNF-α、IL-6、HMGB1的表達水平明顯高于術后4周。熒光實時定量PCR法動態定期檢測發現，宮頸錐形切除術后1～2周宮頸分泌物及組織中TNF-α、IL-6和HMGB1的表達水平達到高峰，之后逐漸降至術前水平。表明宮頸錐形切除術后1～2周時宮頸創面的炎癥在宮頸創面恢復過程中最為嚴重，如果此時行后續的子宮切除勢必出現術中出血多、手術時間延長，手術并發癥及術后感染率高。因此，筆者建議避免在宮頸錐形切除術后1～2周行子宮切除，這樣能規避因手術時機選擇不當而增加的手術風險、手術并發癥及術后感染。本研究還顯示，宮頸分泌物與宮頸組織中炎性細胞消長類似，由于宮頸分泌物取材方便可行，因而通過分泌物中炎癥因子的監測選擇宮頸錐形切除術后子宮全切術最佳手術時間具備可行性。

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醫學統計工作的基本內容

按工作性質及其先后順序，可將醫學統計工作分為實驗設計、收集資料、整理資料、分析資料。實驗設計是開展某項醫學研究工作的關鍵，包括醫學專業設計和統計學設計，醫學專業設計的內容包括研究對象納入和排除標準、樣本含量、獲取樣本的方法、分組原則、觀察(檢測)指標、統計方法等。收集資料的方法包括各種試驗、檢測或調查，要求資料完整、準確、及時、有足夠數量、具有代表性和可比性等。整理資料包括原始資料的檢查與核對、對資料進行分組與匯總等。分析資料即對資料進行統計學分析，包括進行統計描述和統計推斷。

The expression and significance of TNF-α,IL-6,HMGB1 in the cervix uteri after the prior cervical conization*

YinXinming,ZhuXiaolan,WenJian,ZhuLi,TanWeiwei,LiuSongping

(DepartmentofGynecology,ZhenjiangMaternalandChildHealthHospital,theFourthAffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212001,China)

Objective To investigate the dynamic changes and its significance of inflammatory factors in cervical secretions and prior cervical tissues after cervical conical resection.Methods Women who received prior cervical conization during December 2013 and December 2015 in this hospital were selected,then the cervical tissue and secretion were collected regular interval after the conization.The expression of tumor necrosis factor-α(TNF),interleukin-6(IL-6) and high mobility group protein 1 (HMGB1) were quantitative detected and analyzed.The expression and infiltration of inflammatory cell were detected by HE and immunohistochemical staining.Results The expression of TNF-α,IL-6 and HMGB1 in cervical tissues and secretions increased gradually after priorcervical conization,which reached the peak at 1 to 2 weeks after priorcervical conization,and then gradually decreased,the differences were statistically significant when compared with the preoperative control group (P<0.05).The inflammatory cell infiltration and the inflammatory response were most severe at 1st week after the conization.The expression of TNF-α,IL-6 and HMGB1 was at 1st week after the conization were significantly higher than that of the 4thweek group.Conclusion The cervical inflammatory were most severe after the prior cervical conization about 1-2weeks,and the hysterectomy should be avoided at this stage.

prior cervical conization;hysterectomy;tumor necrosis factor-alpha;interleukin-6;high mobility group proteins;postoperative infection

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.11.009

國家自然科學基金項目(81402165,81672913);江蘇省自然科學基金項目(BK20141288);江蘇省鎮江市科技支撐計劃-社會發展基金資助項目(SH2013088)。 作者簡介：殷新明(1973-)，副主任醫師，碩士，主要從事婦科腫瘤、普通婦科臨床工作。

R711.74

A

1671-8348(2017)11-1472-04

2016-11-11

2016-12-27)