辣椒素對體外肝細胞脂質代謝的影響研究*

孫 玉，劉 佳，寧 波,楊朝霞△

(1.重慶醫科大學附屬第二醫院消化內科 400010；2.湖北省武漢市普仁醫院消化與肝病科 430081)

論著·基礎研究

辣椒素對體外肝細胞脂質代謝的影響研究*

孫 玉1，劉 佳2#，寧 波1,楊朝霞1△

(1.重慶醫科大學附屬第二醫院消化內科 400010；2.湖北省武漢市普仁醫院消化與肝病科 430081)

目的 探討辣椒素對脂肪變肝細胞內脂質沉積的影響及自噬表達情況，為脂肪性肝病防治的研究提供新的思路和靶點。方法 用油酸(40 μg/mL)誘導肝原代細胞LO2細胞株建立非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)細胞模型。實驗分為空白對照組、油酸組、辣椒素組[油酸+辣椒素(100 μmol/L)]。油紅O染色和三酰甘油試劑盒檢測肝細胞內脂肪變程度；Western blot檢測自噬體標記分子p62和LC3的表達水平并計算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。結果 40 μg/mL油酸處理LO2細胞24 h后，油紅O染色觀察，油酸組肝細胞中可見大小不等的橘紅色脂滴，而空白對照組無明顯橘紅色脂滴形成，油酸在體外成功建立NAFLD模型。與油酸組相比，辣椒素組肝細胞內三酰甘油水平顯著降低(P<0.05)，脂滴明顯減少，p62蛋白水平明顯降低(P<0.05)，而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯上調(P<0.05)。結論 在體外利用油酸誘導LO2細胞株建立NAFLD模型，辣椒素刺激NAFLD細胞，上調NAFLD細胞自噬水平，減少細胞內脂質沉積，但具體機制還需進一步研究。

油酸；辣椒辣素；非酒精性脂肪性肝病

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD) 是一種無過量酒精攝入，由遺傳-環境-代謝應激相關因素所致的以肝細胞內脂質異常堆積為主要表現的臨床病理綜合征，與2型糖尿病、高血壓和心腦血管疾病密切相關。近年，隨著我國經濟水平的提高，人們生活方式及膳食結構發生了顯著改變，NAFLD的發病率逐年增高，并出現低齡化，嚴重危害公眾健康。我國流行病學調查顯示，南方地區NAFLD發病率低于北方，該現象除了與經濟水平及生活方式有關外同時飲食結構也密切相關[1]。NAFLD發病機制尚未完全明確，探索NAFLD的發病機制，尋求有效可行的治療方法成為當下研究熱點。辣椒素(capsaicin)是辣椒的主要成分，而辣椒是世界各地廣泛被消費的香辛料及蔬菜。隨川菜、火鍋在國內外的迅速發展，引發了人們對辣椒素的關注。早前有研究報道辣椒素具有抗炎、鎮痛、抗氧化等功效[2-4]。現有對于辣椒素的研究主要集中在抗腫瘤方面[5]，而辣椒素降脂方面的研究相對薄弱。有研究證實，在小鼠肝組織中，辣椒素可以促進脂質分解，減少脂質沉積[6]。并且辣椒素能上調血管平滑肌細胞自噬表達，減少血管平滑肌細胞中泡沫細胞的形成[7]。另有實驗表明，自噬的增加可以減少肝臟脂質的沉積，而自噬功能受損同樣可以導致肝細胞脂質的異常沉積[8]。本研究用油酸作用于人正常肝細胞株LO2構建體外NAFLD細胞模型，再加用辣椒素處理脂肪變肝細胞，探討辣椒素對脂變肝細胞內脂質沉積的影響及自噬表達情況，為脂肪性肝病防治的研究提供新的思路和靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人正常肝細胞株LO2由重慶醫科大學肝病研究所提供。胎牛血清(Gibco公司)，三酰甘油檢測試劑盒(長春匯力公司)，辣椒素、油紅O染色劑(Sigma公司)，兔抗p62多克隆抗體(貨號：SC-25730)、兔抗LC3多克隆抗體(Santa Cruz公司,貨號：SC-292354)，青霉素-鏈霉素溶液(100×，碧云天公司)，蛋白提取試劑盒(凱基公司)，RPMI1640培養基、0.25%胰酶(Hyclone公司)。

1.2 方法

1.2.1 構建細胞模型及分組 LO2細胞用含10%胎牛血清、1%青鏈雙抗的RPMI1640培養基進行培養。當細胞鋪滿瓶底，用0.25%胰蛋白酶處理細胞進行傳代培養。后續實驗所用細胞為5 d以內，處于對數生長期的細胞。每2～3天傳代1次，傳3代后的細胞可用于實驗。根據前期實驗結果[9]，MTT 檢測提示油酸濃度超過40 μg/mL時吸光度值下降明顯，對細胞增殖影響較大，故選取40 μg/mL作為油酸最佳誘導濃度，以24 h為最佳作用時間。實驗分組：空白對照組為10%FBS的RPMI1640培養基培養24 h；油酸組為10%FBS的RPMI1640培養液+油酸(40 μg/mL)培養24 h；辣椒素組為10%FBS的RPMI1640培養液+油酸(40 μg/mL)+辣椒素(100 μmo/L)培養24 h。

1.2.2 油紅O檢查各組LO2細胞內脂滴水平 預先將1 cm×1 cm大小的蓋玻片置放于培養板內，5×104/mL LO2分別接種，每6孔為1個樣本，細胞貼壁后開始干預，分別于0、24 h后取出，用PBS漂洗，4%多聚甲醛固定，油紅O染色，60% 異丙醇脫底色，蘇木精細胞核復染，水封片，倒置顯微鏡下觀察細胞內橘紅色，脂滴水平并拍照。

1.2.3 檢查細胞內三酰甘油水平 將細胞接種于培養板內，每6孔為1個樣本，細胞貼壁后開始干預，分別于0、24 h后收集細胞，反復凍融裂解細胞，12 000 r/min離心20 min，取上清檢測三酰甘油水平，按試劑盒說明進行操作，BCA法檢測蛋白水平，計算每毫克蛋白所對應的三酰甘油水平。

1.2.4 Western blot檢查肝細胞自噬蛋白p62及LC3的表達 按總蛋白提取試劑盒說明步驟提取細胞中總蛋白，BCA法進行蛋白定量，分裝后-80 ℃保存，避免反復凍融。蛋白經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后，電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入兔抗LC3多克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗p62多克隆抗體(1∶1 000稀釋)、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)，ECL顯影，以β-actin為內參照。Quntity one4.52圖像分析軟件進行圖像分析，將每個樣本的積分光密度值與β-actin的積分光密度值相比的值，代表其蛋白水平。

2 結 果

2.1 油酸在體外成功誘導建立NAFLD模型 油酸組細胞中即可見大小不等的橘紅色脂滴，而空白對照組無明顯橘紅色脂滴形成。見圖1。

A:空白對照組;B:油酸組。

圖1 油紅O染色觀察NAFLD細胞模型肝細胞內脂滴變化(×200)

2.2 辣椒素對NAFLD細胞脂質沉積影響 辣椒素組細胞脂滴明顯少于油酸組。見圖2。

2.3 辣椒素對脂肪變細胞自噬標志性蛋白p62及LC3-Ⅱ/LC3-I比值的影響 結果顯示，辣椒素組較油酸組p62蛋白水平明顯降低(P<0.05)，LC3-Ⅱ/LC3-I比值明顯升高(P<0.05)。見圖3。

2.4 辣椒素對NAFLD細胞內三酰甘油水平的影響 油酸組三酰甘油水平56.65 μg/mg，與空白對照組24.28 μg/mg、辣椒素組34.62 μg/mg比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

A:空白對照組;B:油酸組;C:辣椒素組。

圖2 油紅O染色觀察各組LO2肝細胞內脂滴變化(×200)

A:p62、LC3的Western blot;B:p62蛋白相對表達量;C:LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值；a:P<0.05,與空白對照組比較；b:P<0.05,與油酸組比較。

圖3 Western blot檢測各組LO2肝細胞p62、LC3的蛋白表達

a:P<0.05,與空白對照組比較；b:P<0.05,與油酸組比較。

圖4 各組LO2肝細胞內三酰甘油水平

3 討 論

NAFLD是代謝綜合征在肝臟的表現，近年來NAFLD發病率逐漸增加，成為當今常見的慢性疾病及公共衛生問題。其發病機制尚未完全明確，治療方法具有一定的局限性。探索安全有效、經濟的治療方法是當前醫務及科研工作人員迫切的任務。辣椒素是辣椒的主要成分，全世界人口中有20%食用辣椒，而我國是主要的辣椒生產及食用大國[10]。依據人們日常經驗和一些文獻報道，食用辣椒具有一定的減肥效果[11]，其簡單易得，食用安全的特性引發了科研工作者對辣椒素的探索。研究表明，辣椒素具有改善心肌重構、減輕動脈粥樣硬化、改善胰島素抵抗、降脂預防肥胖等作用[11-15]。為此筆者猜想辣椒素是否可以改善NAFLD肝細胞脂質的沉積，進一步為辣椒素在肥胖相關代謝性疾病中的運用提供理論依據。

通常情況下獲得人肝臟細胞相對困難，且個體差異大，難于穩定的傳代培養，因此研究脂代謝合適的體外肝細胞系是相當重要的。脂肪酸誘導LO2細胞的脂肪變是研究NAFLD的合適實驗模型，同時油酸可以模擬高脂環境引起細胞內脂質沉積[16-19]。前期實驗證明用40 μg/mL油酸為構建脂變肝細胞模型的最佳濃度，故本實驗應用該濃度油酸刺激肝細胞株LO2，構建NAFLD細胞模型，采用100 μmo/L辣椒素作用于該細胞模型。本研究結果表明，油酸組的三酰甘油和油紅O染色分別從定量和定性的角度證實40 μg/mL油酸誘導人正常肝細胞LO2發生了脂肪變；辣椒素組三酰甘油水平、脂滴明顯少于油酸組，提示辣椒素可以有效抑制脂肪變肝細胞內三酰甘油的聚集。

細胞自噬是廣泛存在于真核細胞內的一種溶酶體依賴的降解產物再利用的過程，可在營養匱乏、電離輻射、氧化應激等情況下被誘導，它可將細胞質內損壞蛋白質、脂質、糖類及功能異常細胞器降解或去除，從而使細胞內環境得以維持穩態[20-23]。近年越來越多研究表明自噬參與細胞內脂質的調節[8,24]，在長期高脂飲食喂養的NAFLD動物模型中，肝細胞自噬受到損傷，由此說明自噬可以有效調節脂質在肝臟的代謝過程，對過度脂質沉積誘導的肝損害具有保護作用[25]。并且體外研究也證實自噬水平提高可以降低NAFLD細胞脂質沉積[6]。p62是一種多功能蛋白，作用于蛋白質降解酶體，可以促進錯誤或損傷蛋白質降解，在自噬過程中起到重要作用，細胞內p62的蓄積抑制自噬的發生。LC3有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式，分別定位于前自噬體和自噬體膜表面，LC3-Ⅱ的水平或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值與自噬的數量呈正相關，一定范圍內p62蛋白水平與自噬水平呈負相關[25-28]。因此p62的蛋白表達水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可作為自噬發生的標記。本研究觀察到，p62和LC3在肝LO2細胞中具有一定基礎水平表達，加入油酸(40 μg/mL)處理后，p62表達水平有所上升、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，說明脂肪變肝細胞模型中肝細胞自噬水平受到損傷，這也再次證實了自噬參與肝細胞脂質代謝過程[24-25]。這與Li等[6]在HepG2及小鼠構建的NAFLD的模型中研究結果一致。當脂肪變肝細胞LO2加入辣椒素其p62蛋白表達明顯降低，而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著高于油酸組，表明辣椒素可能通過上調脂肪變肝細胞自噬水平來減少肝細胞內脂質沉積。這與辣椒素能上調血管平滑肌細胞自噬表達，減少低密度氧化脂蛋白在血管平滑肌細胞中的沉積阻止了泡沫細胞的形成，具有異曲同工之處[7]。

綜上所述，本實驗利用油酸誘導LO2細胞株建立體外肝細胞脂肪變模型，辣椒素刺激NAFLD細胞，上調NAFLD細胞自噬水平，減少細胞內脂質沉積，但具體機制還需進一步研究。

[1]石曉東,魏琪,何淑梅,等.中國東北地區成人非傳染性慢性疾病的流行病學調查及影響因素分析[J].吉林大學學報(醫學版),2011,37(2):379-384.

[2]Liao HT,Lee HJ,Ho YC,et al.Capsaicin in the periaqueductal gray induces analgesia via metabotropic glutamate receptor-mediated endocannabinoid retrograde disinhibition[J].Brit J Pharmacol,2011,163(2):330-345.

[3]Sekine R,Satoh T,Takaoka A,et al.Antipruritic effects of topical crotamiton,capsaicin,and a corticosteroid on pruritogen-induced scratching behavior[J].Exp Dermatol,2012,21(3):201-204.

[4]Devesa I,Planellscases R,Fernándezballester G,et al.Role of the transient receptor potential vanilloid 1 in inflammation and sepsis[J].J Inflam Res,2011,4(1):67-81.

[5]Chien CS,Ma KH,Lee HS,et al.Dual effect of capsaicin on cell death in human osteosarcoma G292 cells[J].Euro J Pharmacol,2013,718(1/2/3):350-360.

[6]Li Q,Li L,Wang F,et al.Dietary capsaicin prevents nonalcoholic fatty liver disease through transient receptor potential vanilloid 1-mediated peroxisome proliferator-activated receptor δ activation[J].Pflu Archiv Euro J Physiol,2013,465(9):1303-1316.

[7]Li BH,Yin YW,Liu Y,et al.TRPV1 activation impedes foam cell formation by inducing autophagy in oxLDL-treated vascular smooth muscle cells[J].Cell Death Dis,2014,5(4):e1182.

[8]Singh R,Kaushik S,Wang Y,et al.Autophagy regulates lipid metabolism[J].Nature,2009,458(7242):1131-1135.

[9]鄭黎黎,沈薇.HBx與肝細胞脂肪變性關系及可能機制的細胞學研究[J].生物技術通報,2010(7):185-190.

[10]鄭龍輝,陸紅佳,劉雄.辣椒素生理功能研究進展[J].食品科學,2011,32(3):262-265.

[11]Zhang LL,Yan LD,Ma LQ,et al.Activation of transient receptor potential vanilloid type-1 channel prevents adipogenesis and obesity[J].Circ Res,2007,100(7):1063-1070.

[12]Ma L,Zhong J,Zhao Z,et al.Activation of TRPV1 reduces vascular lipid accumulation and attenuates atherosclerosis[J].Card Res,2011,92(3):504-513.

[13]Yang D,Luo Z,Ma S,et al.Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension[J].Cell Metab,2010,12(2):130-141.

[14]Kwon DY,Kim YS,Shi YR,et al.Capsiate improves glucose metabolism by improving insulin sensitivity better than capsaicin in diabetic rats[J].J Nutr Biochemi,2013,24(6):1078-1085.

[15]Kang JH,Tsuyoshi G,Le NH,et al.Dietary capsaicin attenuates metabolic dysregulation in genetically obese diabetic mice[J].J Med Food,2011,14(3):310-315.

[16]陳莉,汪春紅,黃邵鑫,等.不同溶劑中油酸對LO2和HepG2細胞生長和活力的影響[J].公共衛生與預防醫學,2012,23(3)：4-8.

[17]Gómez-Lechón MJ,Donato MT,Martínez-Romero A,et al.A human hepatocellular in vitro,model to investigate steatosis[J].Chem Biol Int,2007,165(2):106-116.

[18]Ricchi M,Odoardi MR,Carulli L,et al.Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes[J].J Gastroenterol Hepatol,2009,24(5):830-840.

[19]楊林輝,陳東風.油酸誘導培養肝細胞脂肪變性模型的建立[J].重慶醫學,2007,36(8):698-700.

[20]Dupont N,Codogno P.Autophagy transduces physical constraints into biological responses[J].Int J Biochem Cell Biol,2016,24(16):30238-30242.

[21]Czaja MJ.Two types of autophagy are better than one during hepatocyte oxidative stress[J].Autophagy,2011,7(1):96-97.

[22]Szumiel I.Radiation hormesis:Autophagy and other cellular mechanisms[J].Int J Rad Biol,2012,88(9):619-628.

[23]Kuma A,Mizushima N.Physiological role of autophagy as an intracellular recycling system:With an emphasis on nutrient metabolism[J].Sem Cell Devel Biol,2010,21(7):683-690.

[24]Czaja MJ.Autophagy in health and disease.2.Regulation of lipid metabolism and storage by autophagy:pathophysiological implications[J].Ajp Cell Physiol,2010,298(5):C973-978.

[25]Codogno P,Meijer AJ.Autophagy:a potential link between obesity and insulin resistance[J].Cell Metabolism,2010,11(6):449-451.

[26]Maruyama Y,Sou YS,Kageyama S,et al.LC3B is indispensable for selective autophagy of p62 but not basal autophagy[J].Biochem Biophys Res Commun,2014,446(1):309-315.

[27]Rogov V,Dtsch V,Johansen T,et al.Interactions between autophagy receptors and ubiquitin-like proteins form the molecular basis for selective autophagy[J].Mol Cell,2014,53(2):167-178.

[28]Dancourt J,Melia TJ.Lipidation of the autophagy proteins LC3 and GABARAP is a membrane-curvature dependent process[J].Autophagy,2014,10(8):1470-1471.

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《重慶醫學》編輯部

Effects of capsaicin on lipid metabolism of liver cells in vitro*

SunYu1,LiuJia2#,NingBo1,YangZhaoxia1△

(1.DepartmentofGastroenterology,theSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing,400010,China；2.DepartmentofGastroenterologyandHepatic,PurenHospitalofWuhanCity,Wuhan430081,China)

Objective To observe the effect of capsaicin on lipid deposition in liver cells and the expression of autophagy,to provide new ideas and targets for the study of fatty liver disease.Methods The model of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) was established by inducing LGF cell line of liver primary cells with oleic acid (40 μg/mL).The experiment was divided into blank control group,oleic acid group,capsaicin group[oleic acid+capsaicin(100 μmol/L)].The level of intracellular lipid was detected by oil red O staining and triglyceride (TG) kit.Western bolt was used to detect the expression level of autophagy marker molecule p62 and LC3,and to calculate the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ.Results After treated with 40 μg/mL oleic acid for 24 h,the oil red O staining showed that orange-red lipid droplets were found in the oleic acid group,but there was no obvious orange-red lipid droplet formation in the blank group,which suggesting that the NAFLD cell model was established successfully by using 40 μg/mL oleic acid in vitro.Oil red O staining was observed,the cells in the capsaicin group were significantly less than the oleic acid group,and the content of triglyceride in the liver cells was significantly lower than that in the oleic acid group(P<0.05).Western bolt test results showed that capsaicin group p62 protein levels were significantly lower compared with the oleic acid group(P<0.05),while the LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ ratio was higher than that of oleic acid group(P<0.05).Conclusion NAFLD model was established by inactivating LO2 cell line with oleic acid in vitro.Capsaicin stimulated NAFLD cells,upregulated the autophagy level of NAFLD cells and reduced intracellular lipid deposition,but the specific mechanism need further study.

oleic acid;capsaicin;nonalcoholic fatty liver disease

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.11.003

國家自然科學青年科學基金(81000357)。 作者簡介:孫玉(1989-)，在讀碩士，主要從事非酒精性脂肪性肝病的研究。#并列第一作者：劉佳(1988-)，住院醫師，主要從事非酒精性脂肪性肝病的研究。△

，E-mail：yangzhx2003@163.com。

R575.5

A

1671-8348(2017)11-1450-04

2016-10-21

2016-12-27)