玻璃化凍融囊胚助孕妊娠婦女娩出胎盤Grb10表達分析研究*

林典梁,全 松,康躍凡,易勁松,余愛麗,林 元

(1.福建醫(yī)科大學附屬福建省婦幼保健院輔助生殖技術研究室,福州 350001;2.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學中心,廣州 510515)

·論 著·

玻璃化凍融囊胚助孕妊娠婦女娩出胎盤Grb10表達分析研究*

林典梁1,全 松2△,康躍凡1,易勁松1,余愛麗1,林 元1

(1.福建醫(yī)科大學附屬福建省婦幼保健院輔助生殖技術研究室,福州 350001;2.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學中心,廣州 510515)

目的 對玻璃化凍融囊胚助孕妊娠婦女娩出胎盤中生長因子受體結合蛋白10(Grb10)表達進行分析，評價其安全性。方法 收集2012年1月至2014年5月在福建省婦幼保健院產(chǎn)科門診玻璃化凍融囊胚助孕妊娠的婦女(觀察組)50例及同期自然妊娠婦女(對照組)50例病例數(shù)據(jù)和胎盤標本。采用免疫組織化學、Western blot檢測胎盤Grb10蛋白的表達，Real-time PCR檢測Grb10 mRNA表達。對兩組妊娠婦女的產(chǎn)科結局及胎盤Grb10的表達進行比較分析。結果 兩組孕齡、胎齡，胎兒性別、體質量、身長、頭圍、腹圍比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，娩出胎盤面積、胎盤質量比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組胎盤組織Grb10蛋白表達率、表達強度、免疫組織化學評分比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Real-time PCR、Western blot分析結果進一步顯示兩組胎盤組織中Grb10 mRNA與蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 玻璃化凍融囊胚助孕有可能會增加娩出胎盤的面積與質量，但發(fā)育相關分子Grb10在胎盤的表達未見明顯改變。

囊胚；玻璃化冷凍；胎盤；Grb10

輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)用于臨床已30多年，其非自然生殖的特性及缺乏臨床前安全性研究而直接臨床應用的背景，日益引起人們對其生殖遺傳安全性的關注。雖然目前未發(fā)現(xiàn)ART可直接導致子代出現(xiàn)明顯畸形，但不斷有報道指出，ART子代不良健康風險增加，生長發(fā)育問題就是其中之一，胎兒胎盤過度生長或低出生體質量兒的風險增高，但原因尚不明確，人們擔心可能與ART的一系列操作相關。

囊胚培養(yǎng)與胚胎冷凍為ART重要的衍生技術，近年來研究發(fā)現(xiàn)采用玻璃化凍融囊胚移植治療不孕癥患者能產(chǎn)生較好的助孕結局，其臨床妊娠率、胚胎種植率顯著高于凍融卵裂期胚胎移植。但囊胚培養(yǎng)與玻璃化冷凍技術應用于臨床時間較短，尚缺乏對于出生后嬰幼兒大樣本的長期隨訪資料，其安全性仍是人們關注的焦點。

印記基因生長因子受體結合蛋白10(growth factor receptor-bound protein10，Grb10)是一種可以控制肌肉增長的蛋白?？赡芨淖兗∪獾纳L并促進愈合、肌肉再生和修復過程。2011年報道了一項小鼠行為學研究顯示印記基因Grb10的母本表達涉及胎兒成長、新陳代謝、脂肪儲存，而父本表達調控著成年小鼠的行為活動，是胚胎發(fā)育及多種生理活動中的重要基因。囊胚培養(yǎng)與玻璃化冷凍有可能通過干擾Grb10等印記基因而影響子代生長發(fā)育潛能。尤其在胚胎期，滋養(yǎng)層細胞較內細胞團對環(huán)境因素的干擾更為敏感，經(jīng)過玻璃化冷凍損傷，很可能胎盤組織發(fā)生表觀遺傳修飾異常的風險增加。玻璃化凍融囊胚助孕產(chǎn)科結局及其娩出胎盤Grb10表達情況如何？尚未有文獻報道，因此本文對玻璃化凍融囊胚助孕妊娠婦女娩出胎盤Grb10表達水平進行分析，對其安全性進行評估，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究方案經(jīng)福建省婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會討論批準，在進行研究前與患者進行詳細溝通，在充分知情同意的基礎上，獲得患者夫婦雙方簽字同意后，實施研究方案。收集2012年1月至2014年5月在福建省婦幼保健院產(chǎn)科門診玻璃化凍融囊胚助孕妊娠婦女(觀察組)50例及按年齡配對同期自然妊娠婦女(對照組)50例病例數(shù)據(jù)和胎盤標本。并對兩組孕婦的人口學資料進行比較分析無顯著差異者納入試驗對象。入選標準：孕齡20～35歲；單胎；第1次妊娠；身體健康。排除標準：24周前妊娠丟失病例。所有入選對象分別記錄姓名、孕齡、末次月經(jīng)、預產(chǎn)期、新生兒性別、新生兒體質量、新生兒評分、身長、胎盤面積和體質量、頭圍、腹圍等指標。所有對象分娩時均收集胎盤標本。

1.2 方法

1.2.1 胎盤標本收集 兩組孕婦分娩時，均對胎盤進行詳細檢查，完成胎盤測量，稱取胎盤質量，并記錄所有胎盤相關數(shù)據(jù)。分娩后立即收集胎盤組織，避開胎盤梗死和血管瘤部分，從臍帶植入點旁5 cm處縱向切開胎盤組織。收集胎盤中間部分絨毛，以盡量減少其他部分對基因表達結果的影響。所有胎盤組織在冰預冷的PBS中充分漂洗后，分裝于樣品冷凍保存管中，立即投入液氮中迅速冷凍，后移入-80 ℃冰箱中保存，用于蛋白和基因檢測。用于組織學分析的胎盤組織用4%多聚甲醛固定保存。

1.2.2 免疫組織化學檢測胎盤組織中Grb10蛋白表達 用4%多聚甲醛(0.1 mol/L PBS，pH 7.0～7.6，含0.1% DEPC)進行固定，經(jīng)70%乙醇30 min、80%乙醇30 min、90%乙醇2次×30 min、95%乙醇2次×30 min、100%乙醇2次×30 min、二甲苯透明2次×30 min、55 ℃石蠟中2次×30 min，用銅制模具包埋組織塊。切片后，將厚度3～5 μm的組織切片附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60 ℃烘烤過夜；將切片浸于二甲苯中2次×5 min、100%乙醇2次×5 min、95%乙醇2次×5 min、90%乙醇2次×5 min、85%乙醇2次×5 min、75%乙醇2次×5 min，自來水沖洗，PBS洗2次進行脫蠟、入水。置入1%甲醇雙氧水，室溫10 min，蒸餾水洗1次，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。將切片放入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，在微波爐內微波輻射10 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min進行抗原修復。切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體。切片上滴加第一抗體，4 ℃過夜，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。切片上滴加生物素化的二抗體(IgG)，37 ℃ 20 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min；切片上滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37 ℃ 20 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min。DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒1 mL蒸餾水加顯色劑A、B、C各1滴，混勻，加至標本上，顯色6 min，充分水洗。蘇木素染液復染細胞核1 min，充分水洗,1%鹽酸乙醇分化,1%氨水返藍,充分水洗,經(jīng)70%乙醇5 min、80%乙醇5 min、90%乙醇2次×5 min、95%乙醇2次×5 min、100%乙醇脫水2次×5 min、二甲苯透明2次×5 min,中性樹脂封片。按以下評分標準： A為陽性細胞數(shù)分級，<1%為0、1%～10%為1、11%～50%為2、51%～80%為3、81%～100%為4；B為陽性細胞顯色強度分級0(陰性)、1(弱陽性)、2(陽性)、3(強陽性)；免疫組織化學評分=A×B。對所有切片進行鏡下觀察分析胎盤組織中Grb10蛋白的表達。

1.2.3 Real-time PCR檢測Grb10 mRNA表達 Trizol法提取胎盤組織總RNA(Trizol裂解液購自杭州博日科技)，將總RNA 1 μg逆轉錄為cDNA(逆轉錄試劑盒購自Bioer公司)，取5 μL cDNA應用ABI7500型熒光定量PCR儀進行Real-time PCR(SYBR Green熒光染料購自Roche公司)。引物由上海生工合成，引物序列及長度見表1。Real-time PCR總反應體系20 μL，使用Ultra SYBR Mixture 完成擴增，擴增程序為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s，45個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，無引物二聚體和非特異擴增產(chǎn)物出現(xiàn)。通過實時監(jiān)測PCR產(chǎn)物的動態(tài)積累量，得到各管標本的擴增曲線及目的序列的Ct值，同時檢測該管標本管家基因GAPDH的Ct值，計算各管標本待測序列的△Ct值(△Ct=目的基因Ct值-該管樣品GAPDH的Ct值)，該管標本目的基因的相對表達量為2-ΔCt值。

表1 實驗引物序列

1.2.4 Western blot檢測Grb10蛋白表達 胎盤組織勻漿后提取總蛋白，測定蛋白濃度備用。制備好SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠，取相應體積總蛋白樣品與5×上樣緩沖液,混勻，95 ℃變性10 min，將樣品加到凝膠孔中，電壓調至80 V，使樣品通過濃縮膠與分離膠。凝膠電泳結束后，通過電轉移將凝膠上分離的蛋白條帶轉印至PVDF膜上，然后將膜放入非標記一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗溶液中孵育、標記檢測。待PVDF膜稍晾干，加入化學發(fā)光試劑孵育1 min，迅速用保鮮膜包好后置于暗盒內與Kodak X膠片貼在一起曝光，時間為1 min左右。X膠片經(jīng)顯影、定影后掃描記錄，用image J軟件分析灰度值。

2 結 果

2.1 兩組新生兒結果比較 兩組孕齡、胎齡，Apgar評分，胎兒性別、體質量、身長、頭圍、腹圍比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.2 兩組病例娩出胎盤情況 兩組胎盤面積、胎盤質量比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

2.3 兩組病例娩出胎盤組織Grb10表達免疫組織化學分析

2.3.1 HE染色 胎盤是由胎兒的叢密絨毛膜與母體的基蛻膜共同組成的圓盤形結構中央厚，周邊薄。胎盤的胎兒面光滑，表面覆有羊膜，臍帶附于中央或稍偏，透過羊膜可見呈放射狀走行的臍血管分支。胎盤的母體面粗糙，為剝離后的基蛻膜，可見15～30個由淺溝分隔的胎盤小葉。它由大量的叢密絨毛膜組成。叢密絨毛膜由三級絨毛干組成，絨毛干由其內的結締組織和血管及包圍在外周的細胞滋養(yǎng)層與合體滋養(yǎng)層組成，見圖1。HE染色后組織學分析兩組胎盤均未見絨毛膜病變，如滋養(yǎng)層細胞過度增生、絨毛內結締組織變性水腫、滋養(yǎng)層細胞病變等病理學改變。本研究收集的標本均為健康胎盤，兩組均有可比性。

表2 兩組病例新生兒結果比較

表3 兩組病例娩出胎盤情況±s)

A:觀察組；B:對照組。

圖1 HE染色(×400)

2.3.2 免疫組織化學染色 兩組胎盤細胞滋養(yǎng)層與合體滋養(yǎng)層細胞均不同程度的Grb10的表達，見圖2。兩組胎盤組織Grb10蛋白在表達率、表達強度、免疫組織化學評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

A:觀察組；B:對照組。

圖2 免疫組織化學染色(×400)表4 兩組病例娩出胎盤組織Grb10表達免疫組織化學 分析結果比較

2.4 兩組病例娩出胎盤組織Grb10 mRNA表達比較 結果顯示觀察組(1.02±0.02)與對照組(0.99±0.03)比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.437，P>0.05)。見圖3。

圖3 Real-time PCR檢測Grb10 mRNA在胎盤 組織中的表達

2.5 兩組娩出胎盤組織Grb10蛋白表達比較 結果顯示觀察組(1.44±0.11)與對照組(1.31±0.47)比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.108，P>0.05)。見圖4。

圖4 Western blot檢測Grb10蛋白在胎盤組織 中的表達

3 討 論

囊胚培養(yǎng)與胚胎冷凍保存為ART重要的衍生技術，促排卵周期剩余胚胎培養(yǎng)成囊胚后冷凍保存，可以減少多胎的發(fā)生，以及減胎、卵巢過度刺激綜合征(OHSS)的風險，減少患者刺激卵巢的次數(shù)、多次促排卵費用，增加累積成功率。近年研究發(fā)現(xiàn)采用玻璃化冷凍技術，凍融囊胚移植治療不孕癥患者能產(chǎn)生較好的助孕結局，其臨床妊娠率、胚胎種植率顯著高于凍融卵裂期胚胎移植。尤其對于OHSS高?；颊?，由于其具有年齡小、卵巢反應性好、胚胎回收率高的特點，容易成功培養(yǎng)出高質量的囊胚，冷凍保存，選擇OHSS癥狀消失后擇期解凍移植，能產(chǎn)生較好的妊娠結局。在2011年Zhu等[1]完成了110周期新鮮囊胚和136周期玻璃化凍融囊胚移植，比較發(fā)現(xiàn)解凍囊胚移植的臨床妊娠率和種植率為37.0%和55.1%,顯著高于新鮮囊胚移植的25.2%和36.4%。有學者[2-3]也對新鮮囊胚與解凍囊胚移植進了比較分析，在59周期對111枚囊胚行解凍移植，臨床妊娠率和種植率分別為59.3%和43.2%，繼續(xù)妊娠率為47.5%，單胎率和雙胎率分別為60.7%和39.3%，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。早期研究[4]也發(fā)現(xiàn)對于OHSS高?；颊?，容易成功培養(yǎng)出高質量的囊胚，應采用本文報道的方案實施囊胚解凍移植比較安全高效，即防止因懷孕加重遲發(fā)型OHSS，又能獲得較高的臨床妊娠結局。

正是由于解凍囊胚的成功率高，其臨床應用日益廣泛，以后囊胚解凍移植出生的子代會越來越多，對該技術的安全性評價及妊娠婦女的圍產(chǎn)監(jiān)測研究迫在眉睫。本研究分別對玻璃化凍融囊胚助孕妊娠與自然妊娠病例娩出胎盤進行觀察比較分析，兩組胎盤面積、胎盤質量比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示玻璃化凍融囊胚助孕娩出胎盤大于自然妊娠。潘漪蓮等[5]回顧性分析產(chǎn)前檢查及分娩的760例輔助生育受孕雙胎孕婦(ART組)和764例自然受孕雙胎孕婦(對照組)的妊娠期并發(fā)癥及新生兒結局。結果發(fā)現(xiàn)ART組孕婦平均年齡(32.7±3.5)歲高于對照組(30.0±3.7)歲，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；ART組前置胎盤、產(chǎn)后出血及妊娠期糖尿病發(fā)生率高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；ART組擇期剖宮產(chǎn)率為85.52%，高于對照組(80.09%)，其急診剖宮產(chǎn)導致早產(chǎn)的比例低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；新生兒出生體質量、窒息率、先天畸形發(fā)生率及病死率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。認為ART在雙胎妊娠中會增加前置胎盤、產(chǎn)后出血及妊娠期糖尿病的發(fā)生率，但并不增加其他產(chǎn)科主要并發(fā)癥及圍產(chǎn)兒風險，輔助生育受孕雙胎孕婦并無預防性減胎的必要。姚娟[6]也回顧分析接受輔助生育技術成功妊娠、并獲完整隨訪的1 107例孕婦(觀察組)，選擇同期出生并與觀察組母親年齡及分娩時間均相當?shù)恼Ｊ茉心赣H1 138例作為對照組，比較兩組孕婦圍產(chǎn)期情況和兩組新生兒并發(fā)癥發(fā)生情況。觀察組的雙胎或多胎妊娠率、剖宮產(chǎn)率、早產(chǎn)率和早期先兆流產(chǎn)率均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而對照組的胎兒宮內窘迫的發(fā)生率明顯高于觀察組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。觀察組的死胎率、低出生體質量率、出生缺陷率和新生兒病死率均高于對照組，但僅有低出生體質量率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其部分結果也支持本研究結果，有待于進一步擴大樣本證實。

胎盤是由胎兒的叢密絨毛膜與母體的基蛻膜共同組成的圓盤形結構，進行物質交換是胎盤的主要功能，胎兒通過胎盤從母血中獲得營養(yǎng)和O2，排出代謝產(chǎn)物和CO2。胎盤的合體滋養(yǎng)層能分泌數(shù)種激素，對維持妊娠起重要作用。滋養(yǎng)細胞來源于形成中胚泡的滋養(yǎng)內胚層，是胚泡中最先分化的細胞。滋養(yǎng)細胞的增殖、分化、凋亡和程序性侵入是胚胎發(fā)育、胎盤形成及胎兒生長所必需的。滋養(yǎng)細胞的功能異?？蓪е伦影B前期、子癇、不明原因的流產(chǎn)、胎兒生長受限等妊娠相關性疾病及葡萄胎、侵襲性葡萄胎、絨癌等妊娠滋養(yǎng)細胞疾病的發(fā)生。已經(jīng)有研究表明[7-8]，Grb10可能對早期胚胎發(fā)育有著重要的影響，是胚胎期發(fā)育過程中多臟器表達的一個基因。小鼠行為學研究[9]中顯示印記基因Grb10的母本表達涉及胎兒成長、新陳代謝、脂肪儲存，而父本表達調控著成年小鼠的社會行為，是胚胎發(fā)育及多種生理活動中的重要基因[10-11]。對胎盤Grb10表達水平進行分析可以反應子代生長發(fā)育安全性[12-13]。本研究首次經(jīng)過免疫組織化學染色后，發(fā)現(xiàn)玻璃化凍融囊胚助孕妊娠組與自然妊娠組胎盤細胞滋養(yǎng)層與合體滋養(yǎng)層細胞均有不同程度的Grb10表達。兩組胎盤組織Grb10蛋白在表達率、表達強度、免疫組織化學評分比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Real-time PCR結果顯示，玻璃化凍融囊胚助孕妊娠組與自然妊娠組胎盤組織中Grb10在轉錄水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Western blot結果顯示，玻璃化凍融囊胚助孕妊娠組與自然妊娠組胎盤組織中Grb10蛋白質表達水平組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示囊胚培養(yǎng)與凍融移植尚未對胎盤Grb10的表達產(chǎn)生影響。人類印記基因Grb10在胚胎形成時期，由母方表達，而在胎兒形成后，腦中為父本優(yōu)先表達，母方等位基因在周圍組織和器官中表達。囊胚培養(yǎng)與凍融移植對胎盤Grb10等印記基因[14]表觀遺傳修飾方面是否產(chǎn)生影響有待進一步研究。

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Placental Grb10 expression analysis for evaluation of security for blastocyst vitrification*

LinDianliang1,QuanSong2△,KangYuefan1,YiJinsong1,YuAili1,LinYuan1

(1.HumanAssistedReproductiveResearchUnit,FujianProvincialMaternityandChildren′sHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou,Fujian350001,China;2.CenterforReproductiveMedicine,DepartmentofObstetricsandGynecology,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510515,China)

Objective To analyze the expression of the placenta Grb10 from women conceived by transferred thawed blastocyst,and to evaluate the security of blastocysts vitrification.Methods A cross-sectional study was performed in the Department of Obstetrics and Gynecology of Fujian Provincial Maternity and Children′s Hospital from January 2012 to May 2014,50 women conceived by transferring thawing blastocyst and 50 natural pregnancy control women were enrolled in this study.The expression of Grb10 protein was detected by immunohistochemistry and Western blot,and the expression of Grb10 mRNA was detected by Real-time PCR method.Results Comparison of two cases of gestational age, gestational age, fetal sex, fetal body weight, body length, head circumference, abdominal circumference,there were no significant differences(P>0.05),comparison of placental area, placental weight,the difference was statistically significant(P<0.05).Real-time PCR and Western blot results showed that,there was no significant difference in the expression of Grb10 mRNA and protein between the two groups(P>0.05).Conclusion Blastocysts vitrification may increase the area and quality of delivery of placenta,however,there was no significant change in the expression of Grb10 in placenta.

blastula;vitrification;placenta;Grb10

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.11.001

福建省自然科學基金(2014J01277)；福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項目(2013-ZQN-JC-7)；福建省婦幼保健院科研基金(閩婦幼13-08,13-09,10-01)。 作者簡介：林典梁(1973-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事人類輔助生殖技術研究?！?/p>

，E-mail:quansong@smu.edu.cn。

R715

A

1671-8348(2017)11-1441-04

2016-11-11

2017-01-27)